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乙酸是乙醇发酵的主要副产物之一,也是纤维质原料水解液中一种主要的发酵抑制物。当乙酸浓度高达一定程度时,酿酒酵母细胞活性、生物量积累以及糖的利用都受到明显抑制,高浓度乙酸也会造成细胞程序性死亡,影响纤维素乙醇发酵效率。锌指蛋白(Zinc Finger Protein, ZFP)在基因转录和翻译过程中有着非常重要作用,可以同时调控多基因表达。对转录因子进行人工设计和改造得到的人工转录因子(Artificial Transcription Factor, ATF),包括对人工锌指区基序及其排列顺序进行设计和改造得到的人工锌指蛋白,已经被广泛应用于基础研究、药物设计以及基因治疗等领域,但是,利用人工锌指蛋白改造工业微生物菌种方面的应用研究还不够深入。本文首先将含有人工锌指蛋白编码基因的人工转录因子表达载体文库(ATFs)转入实验室酵母S288c中,筛选得到一株具有较强的乙酸耐受性的突变体,进一步分离得到与乙醇和乙酸耐性提高相关的人工转录因子表达载体pRS316-M01。将pRS316-M01转入工业酿酒酵母Sc4126,重组酵母转化子的乙醇和乙酸耐受性有明显提高。在5 g/L乙酸胁迫条件下,Sc4126-M01表现出延滞期缩短、葡萄糖消耗速率以及乙醇发酵速率加快的优良性能,发酵后期碳源缺乏条件下,该菌株还可以利用培养基中的乙酸进行二次生长。为了探究人工锌指蛋白ZFP-M01提高酵母乙酸耐性机理,用不同浓度乙酸冲击含有ZFP-M01编码基因的菌株Sc4126-M01(以下简称锌指菌)及含有空载体的对照菌株,发现含有人工转录因子的锌指菌Sc4126-M01具有更高过氧化氢酶(CAT)活力和较低的还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)匕值。在没有乙酸存在时,锌指菌具有较低超氧化物歧化酶(SOD)活力,乙酸冲击后,其SOD酶的酶活也低于对照菌株。推测锌指蛋白的表达使细胞具有更强的清除过氧化氢能力,能够避免过氧化氢对细胞的伤害,保持细胞的稳定性。利用人工锌指蛋白的保守结合位点,对酿酒酵母基因组序列进行了分析,预测了可能受到ZFP-M01的调控的靶点基因。实时定量PCR (RT-qPCR)分析结果表明,在乙酸胁迫条件下,锌指菌Sc4126-M01细胞中QDR3, IKS1和YFL040W基因表达发生明显下调。将三个基因分别敲除后,QDR3基因敲除子表现出乙酸耐受性增强,IKS1基因敲除子在高浓度乙醇和乙酸冲击后,存活率有明显提高,而YFL040W具有更高氧化胁迫耐受性。对乙酸耐性提高的QDR3和IKS1突变体进行了进一步的液体发酵实验,在不同浓度乙酸存在的条件下,敲除突变体S288c QDR3A葡萄糖消耗速率和乙醇产率均有明显提高,而S288c IKS1△的发酵效果则相反,IKS1敲除后发酵性能减弱,原因还需要进一步研究。本论文的实验结果首次揭示了QDR3, IKS1和YFL040W在酿酒酵母环境胁迫耐受性中的重要功能,这些结果为进一步深入酿酒酵母的功能基因组研究,揭示人工转录因子在细胞基因表达调控中的作用机制奠定了基础。