多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是我国温带和亚热带地区主要的禾本科饲草和草坪草,广泛地应用在混播草地和草坪绿化。但多年生黑麦草的抗逆性差,叶片在逆境下易早衰,影响其产量和品质。NAC(Nam-ATAF-Cuc)是植物特有的转录因子家族,据报道其参与逆境诱导的叶片衰老过程。实验室前期克隆到一种新颖的转录因子LpNAL(LpNAPLike),在拟南芥和黑麦草中过量表达该基因导致其叶片具有明显的持绿表型。运用Y2H系统从黑麦草cDNA文库中筛选到与LpNAL互作的蛋白,构建多年生黑麦草LpNAL互作蛋白网络图谱,为探索LpNAL与其互作蛋白协同调控多年生黑麦草叶片衰老的分子机制,同时也对多年生黑麦草育种具有重要意义。本研究将LpNAL基因截断去除其编码蛋白的C端转录抑制区,用以构建诱饵蛋白质粒,pGBKT7-LpNAL1-525,同时构建多年生黑麦草cDNA酵母双杂交表达文库。通过酵母双杂交筛库实验获得与LpNAL互作的候选蛋白片段,通过酵母回交实验确定互作蛋白片段。编码蛋白片段的基因测序后,将序列结果比对多年生黑麦草转录组数据和NCBI网站数据库获得编码候选蛋白的基因全长序列,并将其从黑麦草中分离出来。全长蛋白互作又进一步通过Y2H和双分子荧光互补实验(BiFC)手段进行验证。具体研究结果如下:(1)将多年生黑麦草衰老叶片作为材料,构建了高质量的cDNA酵母双杂交文库,经过检测,文库重组阳性率为100%,双杂交文库库容总量为1×107 CFU,其插入片段大小在500-2500bp之间,平均长度为1.5kb。将LpNAL基因截断取开放式阅读框(ORF)起始密码子至525bp片段以去除其编码蛋白的转录抑制区,并构建pGBKT7-LpNAL1-525诱饵蛋白载体,将其转入酵母体内。实验表明:诱饵质粒没有自激活活性,且对酵母细胞无毒性。5mM浓度的3-AT可以完全抑制HIS3在酵母体内的渗漏表达。(2)采用一步转化法将诱饵蛋白和文库同时转化到酵母菌Y2H Gold Yeast感受态细胞中,理论计算获得100万个转化酵母菌,获得42个候选阳性酵母菌。通过提取酵母质粒,扩增和提纯质粒,测序和酵母双杂再验证等手段,得到12个编码蛋白的基因片段利用BLAST程序在NCBI和多年生黑麦草衰老转录组数据库做比对,进一步获得编码候选蛋白的全长编码序列,并克隆其构建酵母双杂交载体上。通过Y2H进行全长蛋白互作验证,获得四个与LpNAL互作蛋白,分别是LpMIELI,LpPR5,LpGl1(β-glucosidase)和 LpNRPB3(DNA-directed RNA polymerases Ⅱ,Ⅳ and Ⅴ subunit 3)。(3)黑麦草原生质体亚细胞定位实验表明LpMIEL1,LpPR5,LpBG1,LpNRPB3蛋白都定位在细胞核。BiFC实验发现LpNAL分别与编码互作蛋白的四个基因在激光共聚焦显微镜下可在细胞核观察到荧光信号,与其所在亚细胞器定位信息一致。综上所述,通过Y2H筛库和进一步蛋白互作验证实验,我们发现LpMIEL1,LpPR5,LpGl1和LpNRPB3四个蛋白与LpNAL蛋白在酵母体内和黑麦草原生质体内互作,初步构建了 LpNAL互作工作网络图谱。该研究为探索LpNAL基因功能和其在多年生黑麦草叶片衰老机制等方面起到一定借鉴作用,同时为黑麦草育种提供新的基因种质资源。