背景和目的:放射治疗是头颈部肿瘤的有效治疗手段,由于头颈部肿瘤所处解剖位置特殊,在放疗实施过程中难免会使正常脑组织受到照射,当大脑掌握认知功能的区域受到照射损伤时,就可能导致放射性认知障碍的发生。目前研究表明,电离辐射诱导认知障碍的机制主要被认为与神经发生障碍、脑内炎症和氧化应激有关,其中神经发生障碍被认为是关键因素。神经发生障碍是神经干细胞不断地进行自我更新并最终分化成神经元,神经元通过轴突末梢与其他神经元构成突触联系,建构神经网络发挥神经功能的这一过程受到干扰和抑制。神经发生主要存在于掌管记忆功能的海马齿状回、侧脑室室管膜下区及嗅球。目前关于电离辐射造成神经发生障碍的分子机制研究报道,更多是研究电离辐射所致神经干细胞微环境的改变,而忽略了神经干细胞自身对于电离辐射所致损伤的修复能力。我课题组前期实验结果表明放射性认知障碍与海马的DNA损伤修复能力相关。因此,我们推测海马神经干/前体细胞中DNA损伤修复可能与神经发生有关。故本研究主要以体外培养的神经干细胞为实验对象,初步研究了较低剂量电离辐射对神经干细胞凋亡、增殖及分化等,并采用ATM抑制剂ku-55933抑制受照神经干细胞DNA损伤修复,来探讨DNA损伤修复对受照神经干细胞凋亡、增殖及分化的影响,为放射性认知障碍分子机制研究提供理论参考。研究方法:本实验第一部分主要探究电离辐射对神经干细胞凋亡、增殖和分化的影响。首先选用13天左右胎龄的C57BL/6孕鼠胚胎脑皮层组织进行原代神经干细胞体外培养,并采用免疫荧光技术进行Nestin染色鉴定所培养细胞为神经干细胞。接着给予神经干细胞0、0.1、0.2、0.5、1Gy X射线照射,并分别予照后不同时间点检测各项生物学指标变化。1.通过使用Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒,经流式细胞仪测定NSCs凋亡情况。2.通过使用细胞计数器观察神经干细胞增殖变化情况。3.应用免疫荧光技术行Tujl或GFAP染色,统计Tuj1或GFAP阳性率,探究电离辐射对神经干细胞向神经元及神经胶质细胞分化能力的影响。本实验第二部分主要探究ATM抑制剂ku-55933对受照神经干细胞凋亡、增殖及分化的影响。首先通过细胞计数实验检测ATM抑制剂ku-55933不同药物浓度下神经干细胞的增殖情况,确定ku-55933的最适工作浓度。后使用最适药物浓度的ATM抑制剂ku-55933对神经干细胞进行预处理,即在细胞受照前1小时予培养液中加入ku-55933,并于照射前将加药培养液换为正常无药培养液。然后探究Ku55933预处理后的神经干细胞接受0.5Gy X射线照射后DNA损伤修复的变化。并测定Ku55933预处理后的神经干细胞经0.5Gy X线照射后多项生物学指标变化情况。实验结果:1.①取自C57BL/6小鼠胚胎大脑皮层区的原代神经干细胞培养3-5天可形成悬浮神经球,并行Nestin染色呈强阳性,表明所培养细胞为神经干细胞。②当体外培养的神经干细胞接受0、0.1、0.2、0.5和1Gy X射线照射后,在不同时间(24、48、72小时)对细胞凋亡进行检测时,发现0.1和0.2GyX射线并未诱导明显的细胞凋亡,0.5Gy X射线在照射后72小时导致明显凋亡,1Gy X射线在照射后24、48、72小时均产生显著凋亡。如照后72h,1GyX射线导致的凋亡是未受照对照细胞的3倍。然而我课题组前期数据表明原代培养的神经元在接受50Gy的X射线照射后48h凋亡仅增加1.9倍,显示出神经干细胞与神经元相比,对电离辐射非常敏感。③体外培养的神经干细胞接受0、0.1、0.2、0.5和1Gy X射线照射后,在不同时间(24、48、72、96小时)对细胞进行计数,发现0.1Gy X射线未对神经干细胞增殖产生明显影响,随着照射剂量增加至0.2-1Gy,电离辐射对神经干细胞的增殖抑制进一步加重,具有剂量依赖性。我们可得出,即使是低剂量照射(0.2Gy),也会导致神经干细胞干性降低,成球能力下降。这提示神经干细胞对电离辐射高度敏感。另外,体外培养的神经干细胞接受0、0.1、0.2、0.5和1Gy X射线照射后,结果发现0.1、0.2Gy X射线照射并未影响其向神经元分化的能力,但接受0.5Gy和1Gy射线的神经干细胞向神经元分化的能力显著下降;除外,所用任何剂量的X射线照射都未显著影响神经干细胞向神经胶质细胞分化的能力。2.体外培养的神经干细胞接受0.5Gy X射线照射后,western blot结果显示ATM的磷酸化显著增加。经ku-55933预处理后行0.5Gy X射线照射,western blot结果显示其ATM的磷酸化显著减少,证实了 ku-55933对DNA损伤修复的抑制作用。同时我们的研究结果显示ku-55933预处理会进一步抑制受照神经干细胞增殖和向神经元分化,与未加药受照细胞相比有统计学意义。结论1.神经干细胞对电离辐射高度敏感,较低剂量电离辐射(≤1Gy)即可导致神经干细胞凋亡增加、增殖抑制及分化成神经元的能力下降,且具有剂量依赖性。但对神经干细胞向神经胶质细胞分化无明显影响。2.在本实验条件下,抑制ATM可进一步抑制受照神经干细胞增殖及向神经元分化能力。该研究表明受照神经干细胞的增殖及分化可能受DNA损伤修复通路所调控。