银杏(Ginkgo biloba)是世界著名的孑遗树种,素有“活化石”的美誉,具有药用、食用、材用等重要的经济价值,同时因其叶形奇特,秋季叶色金黄,还具有特殊的园林景观观赏价值。银杏在中国分布广泛,但由于立地条件的差异,以及天然、人工选择的作用,出现了许多栽培变种。而叶色突变体是研究植物叶绿体发育、光合作用以及光形态建成的理想材料,目前研究大多集中于突变体的发生和遗传规律等方面,而对于叶色变异呈色机理的研究还少见报道。本研究以银杏变异斑叶中的黄叶组织(变异黄叶)和同枝正常发育的绿叶(正常绿叶)为研究材料,通过细胞学观察、色素含量测定,明确银杏变异叶片金黄色性状形成的结构变化以及生理机制;通过高通量测序技术对变异黄叶和正常绿叶进行转录组测序,并结合生物信息学及分子生物学等研究方法对数据进行深入分析,探究银杏变异斑叶中黄叶叶色形成的转录调控机制。主要研究结果如下:(1)银杏变异斑叶和正常绿叶的发育期形态学观察发现,在三月份叶片发育早期,两种类型的银杏叶片呈现相似的表型特征。从四月至八月银杏变异叶片逐渐分化发育成黄绿条纹状斑叶,而同时期的正常叶片呈绿色正常发育。从九月开始银杏变异斑叶与正常绿叶逐渐变黄,至十二月两种银杏叶片完全变黄脱落。(2)超微结构观察发现,银杏正常绿叶中叶绿体的形状规则,呈典型的长椭圆形,叶绿体膜清晰,片层结构完整,细胞内含有少量的质体小球。银杏变异黄叶的细胞内叶绿体发育明显受损,呈不规则形状,叶绿体膜模糊不清,基粒片层垛叠程度相对较低,片层结构疏松分散,分化程度低;细胞内分布着较多且排列密集的质体小球(嗜锇颗粒),同时聚集了大量的液泡。通过软件分析,表明变异黄叶细胞中的叶绿体数量和大小均显著低于正常绿叶。(3)叶片色素含量生理测定结果分析发现,银杏变异黄叶中叶绿素a的含量较正常绿叶下降了 18.4%,叶绿素b的含量下降了 59.5%,总叶绿素含量显著低于正常绿叶。同时叶绿素合成前体物质原卟啉Ⅸ、镁原卟啉Ⅸ以及原叶绿素的含量在变异黄叶中下降了10%～15%。然而,银杏变异黄叶中的类胡萝卜素含量高于绿叶,尤其是叶黄素的积累较多,类胡萝卜素对比叶绿素含量的比例提高。此外,通过测量还发现银杏变异黄叶的类黄酮含量低于正常绿叶。(4)基于Illumina HiSeqTM 4000测序平台对银杏变异黄叶和正常绿叶进行转录组测序(两次生物学重复),共获得四组样品的clean reads分别为41,926,112、54,871,734、52,327,416、39,227,506,Q20在97.93%之上,GC含量约为46.3%。比对到银杏参考基因组的 reads 数为 37,014,921～51,720,246,比对率为 94.16%～94.69%。(5)经差异基因筛选,共获得5235个差异表达的基因,其中银杏正常绿叶对比变异黄叶上调表达的差异基因2933个,下调表达2302个;进一步通过聚类分析,GO功能注释发现差异基因富集在催化活性(catalytic activity)、碳水化合物磷酸酶活性(carbohydrate phosphatase activity)等方面,KEGG通路富集共注释到了 116条通路(pathways),在卟啉和叶绿素代谢(porphyrin and chlorophyll metabolism)、光合作用(photosynthesis)以及类胡萝卜素生物合成(carotenoidsbiosynthesis)等方面均有富集。(6)植物叶绿体的发育以及叶绿素的积累受其编码基因表达水平的影响。研究发现银杏变异黄叶中调控叶绿体发育的GLK、Ftsz 差异基因以及关于叶绿素合成的PPO等差异基因下调表达,而关于叶绿素降解途径中NYC/NOL等差异基因在变异黄叶中上调表达,并且参与光合作用的差异基因大部分在变异叶中下调表达。类胡萝卜素和类黄酮也可以影响植物叶片呈色,银杏变异黄叶中与类胡萝卜素合成相关的差异基因对比正常绿叶呈上升的趋势,而与类黄酮合成相关的差异基因呈降低的表达趋势。(7)转录因子在植物生长发育以及次生代谢等方面具有重要的调控作用。本研究中,我们筛选得到276个差异表达的转录因子,分属于56个转录因子家族。其中,MYB转录因子家族成员最多(10.51%),其次为 bHLH(6.16%)、AP2-EREBP(5.80%)、orphans(5.07%)和WRKY(4.35%)。此外,进一步研究差异转录因子在银杏两种不同类型叶片中的表达情况,发现MYB、bHLH、AP2-EREBP、WRKY、TCP和C2H2等转录因子表达水平在银杏变异黄叶中均有一定程度的下降。(8)应用荧光定量qRT-PCR方法验证了与叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用、类胡萝卜素和类黄酮合成等方面相关的15个差异基因,结果与RNA-Seq表达趋势基本一致,表明了高通量测序结果的可靠性,并为差异基因在三个生长发育阶段的表达变化提供了更多的生物学信息。综上所述,本研究通过细胞学观察、生理生化测定以及转录组测序结合分子生物学和生物信息学等技术,阐明银杏叶色变异斑叶呈色机理,为今后运用基因工程培育植物叶色新品种提供理论基础。