软体动物贝壳的生物矿化过程受到多种贝壳基质蛋白的调控,形成的生物矿化产物并具有良好的力学性能,因此成为了生物工程领域和仿生材料领域学研究的重要对象。贝壳基质蛋白通过调控碳酸钙晶体的成核和生长过程,从而促使贝壳形成有规则的纳米结构并赋予贝壳极强的机械性能。因此,通过多种方法进一步探究贝壳基质蛋白的功能,对分析贝壳的形成过程及这类蛋白对生物矿化的影响有重要意义。本研究以我国具有重要经济价值的贝类——厚壳贻贝为研究材料,鉴定并表征了肌棱柱层特有的两个新型贝壳基质蛋白,分别为collagen-like protein 2(CLP-2)和Gln-rich shell protein(GRSP)。通过开展序列分析、构建原核表达体系、qRT-PCR、原位杂交、体外碳酸钙结晶、免疫荧光、Pull-down等多种手段探索上述两种蛋白在贝壳形成过程中可能的潜在作用。序列分析结果表明厚壳贻贝CLP-2基因序列全长1 640 bp,编码453个氨基酸,具有一段信号肽和两个VWA结构域,理论分子量50.1 kDa,理论等电点pI7.10。GRSP基因的开放阅读框1 788 bp,编码595个氨基酸,含一个PDZ结构域和一个ZM结构域,理论分子量67.7 kDa,理论等电点pI 9.37,是一种碱性蛋白。荧光定量PCR结果表明,CLP-2基因在厚壳贻贝的外套膜中有较高表达量,而GRSP基因在厚壳贻贝的足组织中有较高表达量;原位杂交结果表明两种蛋白均在外套膜边缘和后闭壳肌组织底部(靠近贝壳内表面区域)检测到阳性信号。利用场发射扫描电镜和傅里叶红外光谱分析上述两种贝壳基质蛋白的重组产物对方解石以及文石型碳酸钙晶体在形貌和晶型方面的影响。结果表明rCLP-2和rGRSP蛋白可诱导碳酸钙晶体的形貌发生改变,并促进文石型晶体的形成;结晶抑制实验结果表明,上述两种蛋白的加入可导致方解石晶体的结晶速率下降。采用Pull-down技术结合LC-MS/MS质谱分析分别鉴定CLP-2和GRSP的相互作用蛋白。其中,CLP-2鉴定到15种互作蛋白,GRSP鉴定到18种互作蛋白。此外,通过生物膜干涉技术分别探究了重组CLP-2和GRSP蛋白与Actin的相互作用,结果仅检测到了GRSP与肌动蛋白的亲和力。上述结果表明,CLP-2和GRSP对贝壳的生物矿化过程和超分子化学组成具有重要影响并可能在贝壳肌棱柱层的形成中起到了关键作用。