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大环内酯类抗生素在临床广泛应用,主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染,而细菌对大环内酯耐药现象日益严重。甲基化酶erm基因是导致大环内酯高水平耐药的重要机制之一。文献认为erm催化23S rRNA 2058位腺嘌呤核苷酸的修饰,使其单甲基化或二甲基化。甲基化后的空间结构使细菌与大环内酯的结合位点被隐藏,阻断了大环内酯等抗生素与细菌核糖体之间的结合,从而导致大环内酯、林可酰胺及链霉杀阳菌素耐药。但是erm甲基化作用机制及其对细菌耐药程度的贡献在国际国内尚未见报道。本实验室于临床发病雏鸭脑和脾脏中分离的解没食子酸链球菌巴氏亚种(S.gallolyticus subsp.pasteurianus)中发现耐药基因ermB和ermT,且这两种erm基因介导这些分离株大环内酯高水平耐药。此外,我们还发现不同分离株中ermB单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)引起ermB突变,且其大环内酯MIC存在差异。为了探讨erm甲基化作用机制及其对大环内酯耐药的贡献,本研究优化了ermB和ermT表达体系,选取了ermB进行研究,并基于生物信息学分析及临床分离株中的SNP构建了32种ermB突变体,首次利用微量稀释法对这32种突变体进行筛选,选取了六个突变体,分别检测了它们对23S rRNA的甲基化活性和对大环内酯及林可酰胺的最小抑菌浓度(MIC)。研究结果如下:1、erm B、ermT甲基化酶表达载体的构建与纯化及23S rRNA的分离纯化将ermT耐药基因分别构建到pET28a、pET15b载体上,ermB耐药基因分别构建到pET21b、pET28a载体上,比较蛋白分离纯化结果,选择ermB、ermT构建至pET28a载体的克隆,利用亲和层析纯化出ErmB、ErmT蛋白、MBP-MS2蛋白以及S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S r RNA。2、erm B、ermT的甲基化活性比较用3H标记S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,23S r RNA为底物,对ErmB、ErmT进行酶促动力学试验。两个蛋白的甲基化活性通过液闪仪检测转移到23S rRNA上3H的放射性强度完成。试验结果表明,ErmB和ErmT均可以甲基化修饰S.gallolyticus subsp.pasteurianus 23S r RNA,但ermB甲基化活性要低于ermT。3、erm B突变体构建结合实验室前期解没食子酸链球菌分离株中ermB的SNP,我们选取ermB进行研究。运用生物信息学方法分析erm及ermB同源序列,对ermB保守区域部分氨基酸残基进行突变,构建了32个突变体。4、erm B、ermB突变体MIC值检测粗筛对ermB及其32个突变体进行MIC值检测。结果表明,与野生型ermB的MIC值相比,32株突变体中对红霉素MIC降低的突变体包括:突变菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);对林可酰胺MIC降低的突变体包括:突变菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);对克拉霉素MIC降低的突变体包括:突变菌株58-1(E58A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)。5、微量稀释法测定6株突变体的MIC值通过ermB、ermB突变体MIC值检测粗筛选择6株ermB突变体进行精确MIC值检测,检测结果显示,突变菌株83-1(D83A)对红霉素、克拉霉素、林可酰胺的MIC值分别为:512μg/mL、64μg/mL、512μg/mL;突变菌株139139(R139A)对三种抗生素的MIC值分别为:512μg/mL、64μg/mL、128μg/mL;突变菌株165165(K165A)对三种抗生素的MIC值分别为:1024μg/mL、128μg/mL、128μg/mL;突变菌株4040(K40A)对三种抗生素的MIC值分别为512μg/mL、128μg/mL、256μg/mL;突变菌株37(G37A)对三种抗生素的MIC值分别为:1024μg/mL、256μg/mL、512μg/mL;突变菌株39(G39A)对三种抗生素的MIC值分别为:1024μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL。6、erm B及erm B突变体甲基化活性比较用3H标记S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,23S rRNA为底物,对野生型及突变体ErmB的甲基化活性进行检测。试验结果表明,突变体37(G37A)、39(G39A)酶活性高于野生型ermB甲基化酶活性,突变体40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)酶活性小于野生型ermB甲基化酶活性。7、erm B甲基化酶生物进化树构建利用Mrbays3.1.2生物信息学软件对ermB不同物种进行同源性分析,构建了ermB甲基化酶的系统发育树。结论:ermB、ermT基因构建到pET28a载体上蛋白纯化效果较好。构建的32个ermB突变体与野生型ermB的MIC值相比,对红霉素MIC降低的突变体包括:突变菌株40(K40A)、69-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A);对林可酰胺MIC降低的突变体包括:突变菌株40(K40A)、69-2(E69D)、116-1(E116A)、139(R139A);对克拉霉素MIC降低的突变体包括:突变菌株58-1(E58A)、58-2(E58D)、60-2(E69D)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)。突变菌株37(G37A)、39(G39A)获得的酶活性大于野生型ermB,突变菌株40(K40A)、83-1(D83A)、139(R139A)、165(K165A)获得的酶活性小于野生型ermB,与MIC值变化趋势相符。以上结果说明,氨基酸K40、D83、R139及K165对ermB甲基化活性具有重要作用,这些氨基酸残基进一步影响大环内酯耐药。本研究为揭示大环内酯耐药机制提供了信息,首次建立了MIC值与erm酶活性的关系,为解决核糖体甲基化产生的抗生素耐药问题提供了新的方向。