【摘 要】
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植物乳杆菌p-8生成共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）的过程需要脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase,CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH）和乙酰乙酸脱羧酶（Acetoacetate decarboxylase,CLA-DC）三种酶的共同参与,本研究对植物乳杆菌p-8的
【基金项目】
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国家自然科学基金（31560443）； 内蒙古自然科学基金（2017MS0306）；
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植物乳杆菌p-8生成共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）的过程需要脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase,CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH）和乙酰乙酸脱羧酶（Acetoacetate decarboxylase,CLA-DC）三种酶的共同参与,本研究对植物乳杆菌p-8的CLA-DC进行了原核异源表达、真核异源表达和生物信息学分析,为体外酶催化生产CLA奠定基础。研究结果如下:（1）经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和序列比对分析说明原核表达载体pET-28a-CLA-DC构建成功。（2）经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western Blot检测,证明pET-28a-CLA-DC可在BL21细胞中表达重组酶CLA-DC,且大部分为包涵体。（3）为提高CLA-DC的原核可溶表达量,将CLA-DC基因进行弱化同义突变,设计了三种突变体。结果显示三种突变体有效地提高了CLA-DC的可溶表达量。（4）密码子弱化同义突变表达的原核可溶性CLA-DC经Ni-IDA预装柱纯化后,随着弱化位点的增多,可溶表达量逐渐提高且比活力逐渐增大。（5）经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和序列比对分析说明真核表达载体pPICZαA-CLA-DC构建成功。（6）将pPICZαA-CLA-DC电转入毕赤酵母GS115中,通过PCR鉴定酵母转化子,筛选出阳性转化菌株,经甲醇诱导表达,Western Blot证明重组酶CLA-DC成功表达,为胞外分泌表达。经Ni-IDA预装柱纯化后,比活力为0.018 U/mg。（7）通过对CLA-DC的生物信息学分析发现,CLA-DC蛋白中的丙氨酸和亮氨酸的含量最高,是亲水性蛋白,有与内侧膜能结合的可能,是稳定的胞质可溶蛋白,含22个磷酸化位点。
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