论文部分内容阅读
【目的】 1. 使用人类基因组芯片筛选出缺氧、缺糖状态下人类非腺癌人类肺泡基底上皮细胞A549中与能量代谢调节相关的lncRNA。 2. 根据设定的阈值筛选差异明显的 lncRNA 与 mRNA 关系对，构建lncRNA-mRNA共表达网络并选择出lncRNA的调控靶基因 3. 使用qPCR技术对上述靶基因进行验证。 【方法】 1. 使用人肺腺癌细胞 A549 进行试验，以常氧下 37℃环境+5%二氧化碳+高糖DMEM培养基培养的A549细胞作为对照组，设置、缺氧组、缺糖组、缺糖+缺糖组3个处理组。 2. TRIzol法提取总RNA后使用晶芯? lncRNA4.0芯片进行检测，测定4组细胞的lncRNA-mRNA差异表达情况，并使用qRT-PCR验证筛选结果。 3. 使用晶芯生物分子功能注释系统 V4.0 对上述筛选到的目标基因群进行Go、KEGG Pathway注释以及统计分析 【结果】 1. 合并法计算得出的差异表达 mRNA 在缺氧组对比对照组有 288 个，缺糖组对比对照组有1361个差异表达基因，缺糖、缺氧组对比对照组有4846个差异表达基因；而同时在上述三组均有出现的差异表达基因有44个，合并法并未筛选出在 3 个组别中同时差异表达的 lncRNA。分离法筛选出差异表达的mRNA29个及差异表达的lncRNA27个。 2. 综合合并法和分离法两种统计方式，进行交集得出如下14个基因：PYGL, HOXD11, TCP11L2, PPP1R16A, TTYH3, UPK1A, EFNA3, TMPRSS3, FOS, SFXN3, SCD, DPYSL2, NDUFA4L2, ABCB6。分离法筛选出的27个差异表达的 lncRNA 分 别 为 ： ENST00000418066.2, ENST00000433033.2, ENST00000445000.1, ENST00000457858.1,ENST00000504861.2, ENST00000521622.1, ENST00000528792.1, ENST00000528885.1, ENST00000549161.1, ENST00000560140.1, ENST00000569104.1, ENST00000578585.1, ENST00000582300.1, ENST00000585189.1, ENST00000590092.1, ENST00000597450.1, LIT3481, NR_023922.1, NR_047652.1, RNA147394|p0498_imsncRNA59, TCONS_00012067, TCONS_00027057, uc010wia.1,uc021wad.1, XR_427206.1。 3. 使用 qRT-PCR 验证上述结果， EFNA3, ABCB6, TMPRSS3, PYGL, UPK1A, FOS 6个基因的表达趋势符合芯片检测结果，本次试验筛选出的6个基因所参与的通路包括细胞的应激、胞内离子转运、糖代谢、有氧呼吸、糖无氧酵解、细胞自噬、MAPK的激活等，符合实验预期。 【结论】 1. 本次试验在基因层面验证了A549细胞在缺氧、缺糖情况下，mRNA及lncRNA在多个通路中发生了共同作用。 2. A549细胞在糖剥夺、缺氧应激情况下可能通过lncRNA的表达在转录水平对下游的靶基因进行了调控，而根据lncRNA-mRNA共表达分析结果，此调节途径是客观存在的。 3. EFNA3, ABCB6, TMPRSS3, PYGL, UPK1A, FOS等6个基因经qPCR验证符合基因芯片检测结果。