磷壁酸(Teichoic acids,TA)是革兰氏阳性细菌细胞壁的特有组分,是由多元醇和磷酸以磷酸二酯键形成的阴离子多聚物,具有重要的生理功能。能够断裂磷壁酸骨架的酶被定义为磷壁酸降解酶(Teichoic acid hydrolases)。磷壁酸降解酶本质上是磷酸酯酶,具有磷酸单酯酶或磷酸二酯酶的活性。已有的研究显示,在真菌(黑曲霉)、细菌(主要是芽孢杆菌)、病毒(主要是噬菌体)中都检测到了磷壁酸降解酶活性。利用已知的磷壁酸降解酶GP12序列作为参考,我们在B.subtilis基因组中发现了新的磷壁酸降解酶的基因,yobO、bsp。本研究中,我们将候选基因构建至pET载体中,利用大肠杆菌进行表达。结果,bsp得到了良好的可溶性表达,但即使经过一系列的诱导条件优化,yobO始终以包涵体的形式表达。因而,我们将yobO构建至pHT43载体中转化至B.subtilis进行表达,最终得到了可溶性表达的YobO。经过镍离子亲和层析得到纯化的YobO和BSP。YobO和BSP都表现出对双(对硝基苯基)磷酸盐(bis-pNPP)、对硝基苯磷酸二钠(pNPP)和壁磷壁酸(WTA)的水解活性。我们以bis-pNPP为底物测定了 YobO和BSP的酶学性质。在Tris-Gly缓冲液中,BSP水解bis-pNPP的最适温度为85℃,最适pH为8.4。在37℃,pH 8.0的条件下,YobO和BSP的kcat值分别为分别为2.68±0.09 min-1、6.99±0.23 min-1。二价离子对YobO和BSP的催化活性不是必须的,但对多数二价离子都对BSP的催化活性有促进效果,其中锰离子和钴离子的促进效果最为明显,分别提高了 414%、331%,二价离子对YobO的催化活性没有明显提升。我们进一步利用yobO缺失突变体测定了yobO对B.subtilis 168生长的影响,并推测了其可能的生理功能。我们发现,yobO的缺失使得B.subtilis更早的进入产芽孢阶段。在产孢培养基中培养24 h,野生型菌株的芽孢产率为3.83%,缺失突变体的芽孢产率为47.12%。当培养至36 h时,野生型的芽孢产率为25.93%,缺失突变体的芽孢产率为75.04%。yobO的缺失也对B.subtilis的自溶能力会产生影响。在Triton X-100存在的情况下,野生型菌株与突变体的自溶情况无明显差异,但在无Triton X-100的情况下,缺失突变体表现出更高的自溶速率。表明yobO不会显著影响细胞壁的完整性,但会影响B.subtilis自溶素的活性。