表观遗传学是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化,包括染色体重塑,组蛋白修饰,DNA甲基化等,尤其组蛋白的修饰。本文关注于精氨酸的甲基化修饰。随着人们对精氨酸甲基化的特殊状态的研究深入,其所起到的作用也越来越被关注。精氨酸是带有正电荷的氨基酸,可以调节氢键结合,氨基和芳香基团反应。在多肽中的精氨酸的氮原子可以发生翻译后修饰,连接甲基原子团,这个过程称为精氨酸甲基化。精氨酸甲基化后在精氨酸的胍基的氮原子连接一个或者两个甲基原子团。在真核生物中,主要发生以下三种模式的精氨酸甲基化：o-NG,精氨酸单甲基化(MMA Monomethylarginines);ω-NG, NG-asymmetric精氨酸不对称二甲基化(aDMA asymmetric Dimethylarginines);ω-NG, N’G-symmetric精氨酸对称二甲基化(sDMA symmetric Dimethylarginines)。精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)可以分为类型一和类型二：类型一包括PRMT1, PRMT3, PRMT4, PRMT6,催化形成精氨酸不对称二甲基化(aDMA);类型二包括PRMT5, PRMT7,催化形成精氨酸对称二甲基化(sDMA)。精氨酸甲基转移酶Carml属于精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)的类型一,即具有甲基转移酶活性并催化底物精氨酸发生不对称二甲基化,其甲基化底物包括组蛋白甲基化底物和许多非组蛋白底物；同时具有激活转录以及对pre-mRNA的剪接等生物学功能。随着对Carml研究的深入,Carml在分化发育方面的作用越来越受到关注。Carml-/-的小鼠胚胎很小,新生小鼠死亡；无酶活的Carml knock-in细胞和小鼠与Carml knock-out细胞和小鼠有相似的缺陷,也就是进一步证明Carml在发育过程中发挥作用,其甲基转移酶活性是必需的。进一步的研究证实其在肌肉细胞,脂肪细胞,T细胞分化发育过程中,都起到了不可或缺的作用。为进一步深入地探究Carml在分化发育方面的作用同时结合本课题组已经建立的P19神经分化模型,进一步探究Carml在P19神经分化过程中的机制。一、Carml在P19细胞神经分化过程的表达用0.5μM RA诱导小鼠畸胎瘤P19细胞四天后,撤去RA后用正常的培养基培养后,观察P19细胞形态,看到有明显的神经细胞突触和神经网络；同时检测神经标志基因TuJl。证明成功构建P19细胞神经分化模型。在此基础上,检测Carml的表达变化,结果发现Carml的mRNA水平在RA诱导的一天后就有明显的下降,提示我们Carml对P19的分化可能起到一定的作用。二、Carml在P19细胞神经分化过程中的作用分析基于上述研究以及本实验室的研究平台,构建稳定敲低Carml的P19细胞系后,用RA诱导感染pLKO.1/Carml shRNA3, pLKO.1/Scramble shRNA慢病毒的P19细胞系,在P19细胞分化成神经细胞过程中检测早期神经标志基因Mashl和晚期神经标志基因β-tubulin,诱导结束后分别观察P19细胞神经分化的形态。结果显示：Carml敲低后,甲,期神经标志Mashl基因的升高程度明显低于对照组；同时免疫荧光结果显示Carml敲低后,β-tubulin明显少于对照组,在细胞形态上神经突触也明显少于对照组。进一步提示,Carm1在P19细胞分化成神经细胞的早期以及晚期都发挥了很重要的作用。三、Carm1稳定敲低的P19细胞系中Sox2R113的二甲基化水平为了深入探究Carml在P19细胞神经分化过程中的转录调控机制,我们在Carml稳定敲低的P19细胞系检测了主要的多能性基因Oct4, Sox2, Nanog的表达变化,结果显示这些多能性基因在mRNA和蛋白水平上都没有显著性的变化。本课题组发现Carml可以甲基化Sox2的113位精氨酸。在上述实验的基础上,我们检测稳定敲低Carml的P19细胞系中Sox2的113位的精氨酸的甲基化水平。结果显示Carml稳定敲低的P19细胞中,Sox2的113位的精氨酸甲基化水平明显低于对照组。四、Carml稳定敲低的P19细胞系中H3R2的二甲基化水平在检测了Carml的非组蛋白甲基化底物基础上,检测Carml的组蛋白甲基化底物H3R17和H3R2,结果显示稳定敲低Carml的P19细胞系中,H3R17的二甲基化水平没有显著变化,但是H3R2的二甲基化水平发生了显著的降低。五、Carml稳定敲低的P19细胞系中ERα靶基因的表达Carml在具有精氨酸甲基转移酶的特质外,还具有共激活的特质。有研究报道Carml-/-的成纤维细胞和胚胎细胞中,雌性激素响应的基因表达都是异常的。实验进一步检测了ERα的靶基因并且其受到Carml的共激活调控作用。结果显示,稳定敲低Carml的P19细胞中,5tc2(Stanniocalcin-2)基因的mRNA水平明显降低。综上所述,Carml在P19细胞分化成神经细胞的过程中发挥重要作用,其作用机制可能是：一、通过甲基化多能性基因Sox2来调控多能性基因在P19细胞分化过程中的作用；二、通过甲基化H3R2,来调节P19细胞分化相关基因来发挥作用；三、通过影响核受体响应的基因,来调节P19细胞的分化。