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小麦白粉病和小麦赤霉病是小麦两大真菌病害,严重影响小麦的产量及品质。与化学防治相比,培育和推广抗病品种是防治病害最经济有效且环保的措施。小麦抗病基因的发掘、定位和克隆不但有助于小麦抗病基因工程改良,也有助于深入了解小麦抗病的分子机制。簇毛麦（Haynaldia villosa L.2n=14,VV）是小麦的野生二倍体近缘物种。簇毛麦具有抗白粉病、抗锈病、抗黄花叶病、抗全蚀病的优异性状,是普通小麦遗传改良的优异三级基因库。本实验室在前期研究中,利用基因芯片杂交技术和cDNA文库筛选相结合,在簇毛麦中克隆了一个受病原菌诱导后快速表达的E3泛素连接酶基因CMPG1-V。CMPG1-V转基因小麦在苗期和成株期都表现出广谱的白粉病抗性,同时伴随着SA通路Marker基因表达水平的提高,H2O2积累以及加强白粉菌侵染位点上的细胞壁蛋白交联。为了深入了解CMPG1-V在小麦抗白粉病中的分子机制,利用实验室已构建的簇毛麦酵母双杂交文库筛选CMPG1-V的互作蛋白,克隆了簇毛麦Toxin A Binding Protein 1基因（ToxABP1-V）,主要研究结果如下:1.簇毛麦ToxABP1-V的克隆:克隆获得簇毛麦ToxABP1-V长度为 1095 bp的cDNA序列,含有一个861 bp的ORF,编码286个氨基酸,PI值为9,分子量为32.3 kDa。序列分析发现:ToxABP1-V的N端含有一个叶绿体定位信号肽,第48位的精氨酸（Arg48）为一个切割位点;其C端的231-266位氨基酸含有一个Coiled-coil motif。从中国春、一粒小麦、粗山羊草和簇毛麦的基因组DNA中克隆得到6个ToxABPls的gDNA序列。6条序列均含有5个外显子和4个内含子,ORF长861bp。染色体定位分析表明:ToxABP1-V定位于簇毛麦2V染色体短臂,大麦同源基因ToxABP1-2HS的定位于大麦2H染色体短臂,小麦ToxABP1s定位于第二同源群染色体的短臂上,来自短柄草和水稻的同源基因分别定位于Bd1和R7染色体上,该区域与小麦的2号染色体的短臂存在共线性。2.ToxABP1-V亚细胞定位和表达模式分析:ToxABP1-V蛋白定位于叶绿体中,预测参与叶绿体内囊体膜形成以及光合反应中心PSII的合成和组装。ToxABP1s基因表达具有组织特异性,在叶中的表达量最高,其次是茎和穗,在根和愈伤组织中的表达量低。在簇毛麦受白粉菌诱导24 h后,ToxABP1-V的表达量显著降低;Chitin和flg22处理3 h内,簇毛麦叶片中的ToxABP1-V的表达量没有显著差异。推测ToxABP1-V在小麦抗白粉病中发挥负向调控作用。3.ToxABP1在小麦抗白粉病中的功能分析:首先利用单细胞瞬时沉默分析了ToxABP1在小麦抗白粉病中的功能,发现在中感白粉病品种扬麦158接种白粉菌单小种E26后,其白粉菌吸器指数为50.16%,但在扬麦158中瞬时沉默ToxABP1s基因后,吸器指数显著降低至18.74-19.24%。进一步利用VIGS在扬麦158以及CMPG1-V转基因植株中沉默ToxABP1s能显著提高其白粉病抗性,并提高ROS生成/清除基因、SA通路基因和JA通路基因的表达。进一步利用转基因技术获得ToxABP1 RNAi植株,qRT-PCR表明其中3株T0 阳性植株中ToxABP1s基因的表达量下降至3-8%,它们均表现白粉病抗性显著提高,衍生的3个T1株系（RNAi-ToxABP1-T1-1,RNAi-ToxABP1-T1-2 和 RNAi-ToxABP1-T1-4）抗感白粉病出现分离,分离比分别为3:0,8:4和9:2。利用转基因技术获得ToxABP1-V超量表达植株,利用Western blot共鉴定出18株阳性植株,利用ToxABP1-V特异性引物检测表明这18株阳性植株均检测到ToxABP1-V的表达,并均表现为高感白粉病,其中ToxABP1-V-T0-172衍生的T1代株系ToxABP1-V-T1-9在田间表现高感白粉病。由此可见,过量表达ToxABP1-V不能提高白粉病抗性,而沉默ToxABP1s可以提高白粉病抗性,ToxABP1在小麦抗白粉病中发挥负向调控作用。4.ToxABP1-V的抗性机制解析:分别用H2O2以及植物激素SA、JA和ET处理簇毛麦幼苗,经H202、JA和ET处理1-12 h后,ToxABP1-V基因显著下调,24 h后缓慢上调。ToxABP1 RNAi 阳性植株受白粉病诱导后,ROS生成/清除基因,SA通路基因,JA通路基因表达量提高。CMPG1-V转基因材料对白粉菌单小种E26产生过敏性坏死以及活性氧的积累依赖光照。通过DAB染色和台盼蓝染色发现:ToxABP1 RNAi 阳性植株受白粉病诱导后的ROS积累和细胞死亡显著强于受扬麦158。扬麦158在接菌E26后,其表现出4级感病,扬麦158接E26后ToxABP1的表达量在48h后有微弱的下降。然而CMPG1-V转基因小麦（背景为扬麦158）在接菌E26后,其表现出0级感病。CMPG1-V转基因小麦接E26后ToxABP1表达量急剧下降。扬麦158以及CMPG1-V转基因小麦接种E31后,它们均表现出4级感病。扬麦158和CMPG1-V转基因小麦接种E31后,ToxABP1表达量缓慢下降。酵母双杂交实验表明,ToxABP1-V的C端233个氨基酸跟CMPG1-V以及CMPG1-V的ARM domian存在强烈的相互作用。Pull-down结果表明:ToxABP1-V能与CMPG1-V直接互作。体外泛素化实验结果表明:ToxABP1-V能被CMPG1-V多聚泛素化;体外Cell-free降解实验发现:CMPG1-V能促进GST-ToxABP1-V的降解;烟草注射实验进一步证明:与空载体或者与CMPG1-VCw共注射实验组比较,当ToxABP1-V与CMPG1-V同时注射烟草时,ToxABP1-V的积累量显著降低,当利用MG132阻断26S蛋白酶活性时,能提高ToxABP1-V的积累量。以上结果证明:ToxABP1-V与CMPG1-V直接互作,可被CMPG1-V多聚泛素化和降解,推测ToxABP1-V 为 CMPG1-V 的底物。5.ToxABP1s在小麦抗赤霉病中的功能分析:为研究ToxABP1s在抗赤霉病中的功能,利用VIGS系统在抗赤霉病品种苏麦3号中沉默ToxABP1s。结果表明:与接种BSMV:γ对照相比,接种BSMV:ToxABP1后,其赤霉病感病性显著提高。qPCR结果表明:接种BSMV:ToxABP1后ToxABP1的表达量显著降低;与接种BSMV:γ对照相比,接种BSMV:ToxABP1后,JA信号通路中的TaCO11、TaPR3以及SA信号通路的TaPR1和TaPR2的表达量显著下降,而接种BSMV:ToxABP1后ROS生成/清除基因TaNOX和TaGST的表达量则与接种BSMV:γ相比显著提高。6.麦类LecRKs的进化树构建和LecRK-V介导的抗性机制初步解析:在实验室前期的工作中,从簇毛麦中克隆了LecRK-V,发现簇毛麦受白粉菌和几丁质处理后LecRK-V表达快速上调;在中感白粉病品种扬麦158中瞬间过量表达LecRK-V能显著降低白粉菌吸器指数,超表达LecRK-V转基因植株的苗期和成株期白粉病抗性显著提高。与扬麦158相比,LecRK-V转基因植株苗期显著提高对23个白粉菌小种中的18个小种的抗性,对其中的22个小种表现出HR反应,在白粉菌侵染位点处ROS显著积累。本研究进一步针对LecRKs开展研究,取得得以下主要结果:发现LecRK-V定位于簇毛麦染色体5V上,通过搜寻不同禾谷类物种LecRKs,构建了包含276个LecRK的系统进化树,将它们划分为11类。通过Southern杂交,发现LecRK-V已经整合进转基因株系LecRK-V-T3-2基因组中,含有两个拷贝。利用qRT-PCR发现,LecRK-V转基因植株中ROS生成/清除基因和SA信号通路基因的表达显著提高,说明ROS和SA通路参与了 LecRK-V介导的白粉病抗性。