视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，常可致盲、致残和致命。对RB治疗的目的是完全控制肿瘤、保住患者的生命并且保持有用的视力，有关RB的治疗自1990年以来己提出了新概念。随着早期准确诊断和及时治疗病例的增加以及新技术的应用，在发达国家多年来常用于治疗RB的眼球摘除已明显少用，更多地是根据肿瘤的大小、位置和范围以及分类进行综合治疗，大大提高了治疗效果。而在我国，眼球摘除仍是主要的治疗方法，为保住患眼，其他的治疗方法已越来越多地被关注。化疗减容法是一种减少肿瘤容积和不良反应的治疗方法，它已发展成为眼内期RB保守治疗的重要组成部分。但有相当一部分RB对化疗不敏感，存在多药耐药现象，逆转耐药成为了我们提高RB治疗效果所要克服的重要障碍。 多药耐药(multidrugresistance，MDR)是指肿瘤细胞对多种结构和作用机制不同的化疗药物产生交叉耐药性，是肿瘤化疗失败的重要原因。体外研究显示，第一代逆转剂如环孢霉素A、维拉帕米等逆转MDR效果肯定，但由于它们发挥逆转作用时的剂量存在严重副作用，从而限制了其临床应用。为了克服这些缺点，第二代逆转剂如环孢菌素D衍生物PSC833、VX-710等逐渐被开发出来，其心脏毒副作用明显减少。然而，这些逆转剂会导致化疗药物药动学发生改变，增加了对正常组织的毒性。使其不能广泛在临床上应用。因此，寻找高效、低毒、作用靶点广泛的逆转剂是目前研究的趋势。Li-mingChen等通过体外和体内实验证实一种新的合成物2-[4-(2-嘧啶-2-乙烯基-苯基]-4，5-双丙稀酰胺-(4，N，N-二乙胺苯基)-1(H)-咪唑即FG020318具有逆转MDR的功能，而且低毒、效果肯定。 为了验证这种新的逆转剂FG020318是否能对RB多药耐药现象产生逆转作用并提高RB对化疗药物的敏感性，我们进行了视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50的培养，并模拟临床上的化疗周期，采用Rb化疗中最常用的一种抗癌药物长春新碱(vincristine，VCR)诱导S0-Rb50细胞系成为耐长春新碱细胞株SO-Rb50/VCR。成功诱导出能耐受200ng/mlVCR的耐药细胞株后，我们对其耐药的逆转作了进一步的研究，寻找其逆转的可能机制，为RB的临床化疗提供新的思路。 一、研究目的 通过建立耐药细胞株，检测RB细胞系S0-Rb50与其耐药细胞株SO-Rb50/VCR三种耐药基因和耐药蛋白的表达情况，分析其产生耐药的可能机制，以及探讨药物对耐药现象的逆转，以期在体外实验层次为临床使用一种新合成的药物FG020318逆转视网膜母细胞瘤多药耐药性的安全性和可行性提供可靠的依据。 二、实验方法 第一步是首先采用长期、单一、小剂量逐渐加药的方法，诱导RB细胞系SO-Rb50成为耐长春新碱细胞株SO-Rb50/VCR，再用MTT法分别测定S0-Rb50和SO-Rb50/VCR对长春新碱等六种化疗药物的IC50值，对比其差异以确定其多药耐药现象的发生。 第二步是分别采用荧光定量RT-PCR检测其多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)基因、肺癌耐药蛋白(LRP)基因的表达，比较其差异。用免疫组化法分别检测细胞耐药前后p-gp、p190、LRP蛋白的表达，比较其差异。 第三步是在耐药株里加入逆转剂，按加入药物的浓度的不同进行分组，用MTT法检测细胞毒性，用流式细胞仪检测细胞蓄积罗丹明123。 三、结果 1、经过八个月的诱导，细胞系SO-Rb50能在含VCR200ng/ml的培养液中生长，成为耐药细胞株SO-Rb50/VCR。SO-Rb50对VCR的IC50是O.023ug/ml，而耐药细胞株SO-Rb50/VCR对VCR的IC50是2.254ug/ml，表明SO-Rb50/VCR对VCR的耐受程度是SO-Rb50的97倍。 2、SO-Rb50表达MDR1、MRP、LRP基因，用荧光定量RT-PCR检测三种基因的Ct值分别是26.23、26.45、24.97。而SO-Rb50/VCR也同样表达MDR1、MRP、LRP基因，用荧光定量RT-PCR检测三种基因的Ct值分别是19.43、21.17、19.09。S0-Rb50/VCR的三种基因的Ct值都分别比SO-Rb50小，其差异有统计学意义，表明耐药后基因表达的拷贝数较耐药前高。 3、SO-Rb50表达P-gp、MRP及LRP三种蛋白，用免疫组化法测得其阳性率分别是45.33、40.48、56.92。SO-Rb50/VCR也同样表达P-gp、MRP及LRP三种蛋白，用免疫组化法测得其阳性率分别是85.67、86.21、97.26。耐药前后三种耐药蛋白的表达差异有统计学意义。 4、2.5μmol/L的FG020318可使SO-Rb50/VCR的IC50值下降32.23倍，5μmol/L时下降48.35倍，10μmol/L时可下降52.95倍。在同为5μmol/L时，FG020318的逆转倍数是环孢霉素A的5.02倍。用FG020318处理2小时后，耐药株SO-Rb50/VCR对罗丹明123的蓄积随着FG020318浓度的逐渐增大而逐渐增加，各浓度组与对照组比较及组间比较有统计学意义。 四、结论 1、以对VCR敏感的RB细胞系SO-Rb50细胞为亲本，通过诱变剂甲基磺酸乙酯刺激，采用长期、单一、小剂量用药的方法在培养液中加入浓度递增的VCR，可以得到能在含VCR200ng/ml的培养液中正常生长的耐药细胞株SO-Rb50/VCR。 2、RB细胞系S0-Rb50存在多药耐药现象，包括原发耐药和继发耐药，耐药的机制可能如下： ①MDR1编码产物即糖蛋白p-gp的过度表达，促使细胞内药物浓度降低。 ②MRP基因编码产物p190的过度表达，减少细胞内药物的聚集。 ③LRP过度表达，使靶点药物有效浓度下降。除此之外，可能存在其它的耐药机制。 3、一种新的肿瘤耐药逆转剂FG020318可部分逆转耐药细胞株SO-Rb50/VCR的耐药性，其逆转机制主要是促使细胞内药物蓄积浓度的增高。 4、如果RB肿瘤细胞存在耐药基因及其产物蛋白的过度表达且对化疗不敏感，可以在常规化疗方案中增加FG020318，以逆转耐药，增加化疗的敏感性。