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动物疫病一直危害着畜牧养殖业的健康发展,大多数动物疫病主要通过接种疫苗来加以控制,疫苗配合免疫增强剂使用可更好地发挥疫苗的防控作用,而市场上常用的免疫增强剂多伴有毒副作用大等缺点,因而急需研制新型免疫增强剂。近年来的研究发现,多糖具有很好的增强免疫活性作用,且硒化后的多糖可进一步提高多糖增强免疫活性作用并产生新的药用价值。中医多善于使用中药复方来达到防治疾病作用。因此,本研究首先提取制备了七种中药多糖和三种硒化多糖,以多糖与硒化多糖9:1的比例制成18个多糖-硒化多糖复方,通过体外免疫增强试验初步筛选出3个作用较强的复方,进一步通过体内免疫增强试验筛选出作用1个作用最强的复方,并探讨了其作用机理。本研究的目的,旨在筛选增强免疫活性最强的多糖-硒化多糖复方,为研制新型免疫增强剂提供理论依据。试验分为以下五个部分:试验Ⅰ、七种中药多糖及三种硒化多糖的制备 用水煎醇沉法分别提取党参多糖(CPP)、当归多糖(CAP)、大蒜多糖(GP)、百合多糖(LP)、白术多糖(AMP)、枸杞多糖(LBP)五味子多糖(SCP);CPP、CAP和GP分别用Sevage法、三氯乙酸法去蛋白质,过DEAE-52纤维素、Sephadex-G 200葡聚糖凝胶柱,用硝酸-亚硒酸钠法修饰,得到硒化党参多糖(sCPP)、硒化当归多糖(sCAP)和硒化大蒜多糖(sGP);分别用改良硫酸-苯酚法和氢化物发生-原子荧光光谱法测定多糖糖含量和硒含量。结果显示,CPP、CAP、GP、LP、AMP、LBP、SCP的得率依次为 12.94%、13.84%、15.36%、33.68%、14.46%、12.71%、63.42%,糖含量依次为68.2%、31.5%、61.3%、69.67%、56.0%、36.5%、59.3%;sCPP、sCA、sGP的糖含量依次为61.11%、50.90%、52.2%,硒含量依次为 11.86 mg.g-1、12.98 mg.g-1、11.36 mg.g-1。试验Ⅱ、多糖-硒化多糖复方体外增强免疫活性的比较 以7种多糖和3种硒化多糖组成18个多糖-硒化多糖复方,以组分药的安全浓度确定各方的安全浓度,取安全浓度范围内5个浓度的各方,单独或与PHA加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(A570值和淋巴细胞增殖率)的变化。结果显示,单独刺激时,18个复方在所有浓度组的A570值均大于、在一些浓度组显著大于细胞对照组,淋巴细胞增殖率排在前三位是CAP-sCPP(18.55%)、GP-sCPP(15.38%)和CPP-sCAP(15.18%);与PHA共同刺激时,18个复方在所有浓度组的A570值均大于、在一些浓度组显著大于PHA对照组,淋巴细胞增殖率排在前三位是CAP-sCPP(18.28%)、CPP-sCAP(14.08%)和 GP-sCPP(12.96%)。结果表明,18 个复方均具有不同程度的免疫增强作用,CAP-sCPP、CPP-sCAP和GP-sCPP的作用较强。试验Ⅲ、多糖-硒化多糖复方体内增强免疫活性的比较 比较了体外试验筛选出的免疫增强作用最强的3个多糖-硒化多糖复方(CAP-sCPP、CPP-sCAP和GP-sCPP)的体内免疫增强活性。240羽14日龄健康雏鸡随机均分为8组,每组30羽,除空白对照组(BC)外均用鸡新城疫Ⅳ系疫苗免疫,28日龄二免,在每次免疫的同时,6个多糖复方组分别肌肉注射高(10 mg.mL-1)低(5 mg.mL-1)浓度的3个复方多糖溶液0.5 ml,免疫对照组(VC)和BC组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于首免后7(D7)、14(D14)、21(D21)和28(D28)d心脏采血测定淋巴细胞增殖、翼下静脉采血测定血清新城疫抗体效价和IL-2、IL-6及IFN-γ的含量。结果显示,GP-sCPPH 在 D7、GP-sCPPH 和 GP-sCPPL在 D14、GP-sCPPH、CPP-sCAPH 和 GP-CPPL组在D21、GP-sCPPH、CPP-sCAPL和GP-sCPPL组在D28的A570值均显著高于VC组和BC组,GP-sCPPH组在4个时间点的淋巴细胞增殖率最高;GP-sCPPH、CAP-sCPPH、CAP-sCPPL 和 GP-sCPPL 组在 D7、GP-sCPPH、CAP-sCPPH、CAP-sCPPL、CPP-sCAPH和 GP-sCPPL 组在 D14、GP-sCPPH 组在 D21、GP-sCPPH、CAP-sCPPH、CAP-sCPPL、GP-sCPPL、CPP-sCAPH和CPP-sCAPL组在D28的血清抗体效价均显著高于VC和BC组,GP-sCPPH组在4个时间点的血清抗体效价均为最高;3个复方高、低浓度组的血清IL-2、IL-6及IFN-y的含量均高于或显著高于VC和BC组,GP-sCPPH组在4个时间点的含量均为最高。结果表明,3个复方均能增强鸡新城疫疫苗的免疫效果,GP-sCPP的作用最强。试验Ⅳ、GP-sCPP复方增强免疫作用的验证 比较了 GP-sCPP及其组分药sCPP和GP的增强免疫活性。14日龄健康雏鸡150羽随机均分为5组,每组30羽,除空白对照组(BC)外均用鸡新城疫Ⅳ系疫苗免疫,28日龄二免,在每次免疫的同时,3个多糖组分别肌肉注射 GP-sCPP(10 mg.mL-1)、sCPP(2 mg.mL-1)和 GP(8 mg.mL-1)溶液,免疫对照组(VC)和BC组注射等量生理盐水,每天1次,连续3d。分别于首免后7、14、21和28 d,心脏采血测定淋巴细胞增殖、翼下静脉采血测血清新城疫抗体效价和血清IL-2、IL-6及IFN-γ的含量。结果显示,GP-sCPP组在4个时间点的A570值均显著高于VC和BC组,在D28显著高于sCPP组和在D14显著高于GP组;GP-sCPP组在4个时间点的抗体效价均为最高,均显著高于VC和BC组,在D7和D14显著高于sCPP和GP组;sCPP-GP组在4个时间点的血清IL-2、IL-6和IFN-γ含量均为最高,显著高于VC和BC组,在一些时间点显著高于sCPP和GP组。结果表明,GP-sCPP的免疫增强作用可靠,显著强于其组分药sCPP和GP。试验V、GP-sCPP复方对鸡淋巴细胞亚群及IL-2和IFN-γ的mRNA表达的影响为了探讨GP-sCPP复方增强免疫作用机理,测定了 GP-sCPP、GP和sCPP对鸡外周血淋巴细胞亚群及IL-2和IFN-γ的mRNA表达的影响。分离鸡外周血淋巴细胞,分别加入3个浓度的GP-sCPP、GP和sCPP溶液培养。取培养48 h的淋巴细胞,用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞的含量。取培养12 h的淋巴细胞,提取RNA,反转录成cDNA,用荧光定量RT-PCR技术测定淋巴细胞IL-2、IFN-γ的mRNA表达的变化。结果显示,GP-sCPP所有浓度组、sCPP高、中浓度组和GP的高、中浓度组的CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+比值均显著高于ConA组;GP-sCPP高、中浓度组和sCPP高浓度组的IL-2 mRNA表达均显著高于ConA组;GP-sCPP所有浓度组、sCPP高浓度组和GP的高、中浓度组的IFN-γ mRNA表达均显著高于ConA组。结果表明,GP-sCPP能显著促进CD4+淋巴细胞增殖,提高CD4+/CD8+比值,促进IL-2和IFN-γ的mRNA表达,作用显著强于其组分药,可能是GP-sCPP增强免疫作用的部分机理。