一、研究背景阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)是临床上的常见病,多发病。至今未发现有效治疗药物。Aβ级联学说是至今公认的AD发病机制假的说之一,该学说认为AD的发病的关键点是细胞外Aβ过度沉积。而且越来越多的证据显示,AD及转基因动物脑内存在神经元内自噬功能紊乱,大量自噬体及自噬溶酶体聚集于细胞内,成为Aβ产生、聚集的场所,造成轴突功能损害、突触损害,甚至自噬性神经元死亡。LC3Ⅱ是自噬被激活的标志,其与自噬选择性底物P62互作用形成蛋白复合物,在P62依赖的方式下,最终自噬降解。因此LC3Ⅱ与P62在自噬过程中一始一末的协同作用,共同反映了自噬水平。我们前期实验初步肯定了电针对AD模型小鼠脑组织Aβ整体水平的降低调节趋势,并存在对自噬状态产生影响的可能性——针刺通过抑制细胞自噬功能异常亢进从而保护细胞免受Aβ的毒性作用。"肾气亏虚,浊淤蒙窍"是AD的主要中医病机。AD的病理性产物Aβ,应属内生之痰浊淤血。Aβ沉积所产生的神经毒性,导致了认知功能的障碍,其机制和中医脑内"浊瘀蒙蔽脑窍"病机相似。肾气亏虚、气化不利的微观表现可能为神经元内的自噬功能紊乱,是AD病机之本。针刺"益肾祛浊通窍"治疗AD的微观基础可能是调节紊乱的自噬状态,降低脑内Aβ水平,从而有效地预防和控制AD。为此,本研究以APP/PS1双转基因鼠为AD动物模型,在AD的关键标志物Aβ水平降低的已有基础上,观察AD小鼠病理中期学习记忆行为学及自噬水平改变,以探求AD的发病机制及针刺治疗AD的机理,为针刺"益肾祛浊"法治疗AD提供实验依据。二、研究目的和意义本实验拟在前期实验结论证实电针可降低APP/PS1双转基因鼠脑组织Aβ水平的结论基础上,证实针刺具有抑制自噬,从而降低Aβ水平、改善AD学习记忆能力的作用,为电针"益肾祛浊"法防治AD提供实验依据和理论支持。三、研究方法本实验以18只雄性5月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为AD动物模型,模型满5月龄时称重排序,利用随机数表进行完全随机分组,将其分为2组:电针组和模型组,每组9只。9只同窝同月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因阴性小鼠为阴性对照组。将小鼠用自制鼠板固定于操作台面上,在头顶部正中取"百会"穴,在两足底前、中1/3交界处取"涌泉"穴。选用一次性针灸针(北京中研太和医药公司生产),规格0.25×13mm。穴位针具常规消毒,刺入2-3mm深,"百会"穴手针,双"涌泉"穴小幅度捻转后接韩式电针仪,采用疏密波,频率1/50Hz,强度0.5mA,以针柄微颤,小鼠保持安静不挣扎嘶叫为度。每次针刺时间持续15min,隔日1次。一共治疗6周。模型组和正常对照组:相同方法用鼠袋束缚15min,不做针刺干预,隔日1次,共束缚6周。干预治疗实施结束后,用Morris水迷宫行学习记忆行为学检测,以空间记忆学习记忆行为学相关指标展示电针干预AD的治疗效果。蛋白质免疫印记(Western blot)检测海马LC3Ⅱ、P62蛋白水平。另外每组各3只小鼠,麻醉小鼠,行心脏灌注固定后取脑,选取海马CA1区和颞叶皮层进行树脂包埋。切片后行用醋酸铀/柠檬酸铅双重染色,用透射电镜观察皮层及海马神经细胞自噬体、自噬溶酶体等超微形态,以及老年斑的形成状况。四、实验结果1.morris水迷宫结果显示,各组逃避潜伏时、经过平台次数、平台象限时长差异无统计学意义(P>0.05);模型组与正常对照组相比,逃避潜伏时增加(P<0.01);针刺和模型组逃避潜伏时比较无统计学意义,但可见针刺组小鼠到达平台的潜伏期不断缩短,整体用时曲线较模型组呈下降趋势。随着训练天数的增多,对照组与其他各组相比都有明显差异(P<0.05)2.Western blot结果显示,三组LC3Ⅱ组间差异有统计学意义(P<0.05),P62各组差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,模型组海马LC3Ⅱ表达增强,说明自噬激活,P62表达减弱,说明自噬流通畅,自噬降解力随自噬的激活相应增强(P<0.05);与模型组相比,针刺组LC3Ⅱ表达减弱,P62表达增强,(P<0.05),说明针刺组能抑制自噬功能的异常亢进,降低自噬泡的过多累积。3.透射电镜结果显示:在7月龄AD小鼠海马内存在致密性神经炎性斑块及营养不良性突起;营养不良性突起及神经细胞内存在大量自噬泡和次级溶酶体,提示该小鼠模型自噬功能活跃。而针刺组情况有所改善。五、研究结论及意义5月龄APP/PS1转基因小鼠成功模拟了 AD病理改变中的老年斑和相关退行性变,并存在神经元自噬功能亢进。电针通过抑制自噬水平,降低海马Aβ的生成及沉积,从而改善脑部学习记忆能力。