鸡沙门菌病抗体间接ELISA检测方法的建立

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鸡沙门菌病在我国仍然广泛流行,严重危害养鸡业。外表健康的患鸡容易向外排菌,使鸡蛋、鸡肉等产品遭受污染,给食品安全和公众健康带来一定的危险,容易造成人食物中毒。由于沙门菌感染后能终身带菌,并可通过种蛋垂直传给雏鸡,因此鉴定并淘汰阳性种鸡十分必要。长期以来,养鸡场一直使用玻板凝集试验检测淘汰患鸡白痢、鸡伤寒的病鸡,但是该方法敏感性有限,经常漏检。感染鸡间歇性排毒或不排毒,使得传统分菌的方法不够敏感。感染性沙门菌血清型众多,传统ELISA方法不能满足实际需求。沙门菌InvJ蛋白是广泛存在于沙门菌中的保守蛋白,使用该蛋白检测沙门菌抗体,可以有效地检出被沙门菌感染的鸡。因此,本试验采用分子克隆方法,得到InvJ蛋白,将其作为检测抗原,研制出能检测沙门菌InvJ抗体的间接ELISA方法,现将结果报告如下。1.沙门菌InvJ基因的克隆与融合蛋白的表达同源性分析显示沙门菌InvJ蛋白和其他细菌的蛋白同源性低,在沙门菌中是一个保守蛋白。根据Genbank (CP003047)上公布的鸡伤寒/白痢沙门菌InvJ序列设计引物,成功在肠炎沙门菌标准株(CVCC3375)中扩增得到InvJ基因,将该基因连接到pET-28a(+)表达载体,构建融合质粒pET-in4,将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,成功诱导出融合蛋白。Western-blot结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。2.检测沙门菌InvJ抗体的间接ELISA方法的建立使用纯化后的融合蛋白包被酶标板,建立间接ELISA方法,经试验确定最佳检测条件:包被浓度为0.17μg/mL,包被液为磷酸盐缓冲液(20mmol/L,pH7.0),4℃包被12h,使用5%脱脂奶粉作为封闭液,37℃封闭90min,使用PBST将待检血清稀释800倍检测,血清孵育时间为45min,二抗孵育时间45min,显色时间为15min,阳性临界值为0.162。重复性试验结果显示该方法重复性良好。使用所建方法对9个鸡场655份血清进行了检测,阳性率最低0,最高100%。该方法的建立为鸡场沙门菌病的诊断提供了一种便捷可靠的工具。
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