目的： 一，建立含有转化生长因子βi（TGF-β1）的促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的特殊诱导体系，研究在含有TGF-β1等特殊诱导成分培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力及其生物学特性。 二．探讨采用5-2溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记骨髓间充质干细胞技术，标记诱导骨髓间充质干细胞形成的软骨细胞的可行性。 三，探讨通过Transwell技术共培养观察兔软骨细胞体外诱导采用BrdU标记的人脐血间充质干细胞分化成软骨细胞的可行性。 四，探讨同种异体小肠黏膜下层支架复合骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞后修复兔耳廓软骨缺损的可行性。 五，探讨新型丝素蛋白/壳聚糖大孔微载体材料复合同种异体骨髓间充质干细胞修复兔耳廓软骨缺损的可行性。 方法： 一．TGF-β1特殊软骨诱导体系建立和观察方法从兔胫骨结节内侧抽取骨髓，采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞并将其加入含有转化生长因子β1（TGF-β1）和转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠等成分的特殊软骨诱导体系进行诱导培养；分别对诱导培养14d后的骨髓间充质干细胞及体外培养的第二代人鼻中隔软骨细胞进行形态学观察和免疫组织化学DAB染色Ⅱ型胶原定性检测。 二、诱导BrdU标记的骨髓间充质干细胞形成软骨细胞方法将BrdU标记过的兔骨髓间充质干细胞按标记时间的不同，采用台盼蓝标记染色法计算出活细胞率，应用SPSS13．0统计软件单因素重复测量方法分析进行数据处理，比较标记时间长短对兔骨髓间充质细胞活性有无显著性差异；采用Transwell技术，将BrdU标记过的兔骨髓间充质干细胞与体外培养兔关节软骨细胞进行非接触式共培养，运用免疫组化染色方法检测共培养体系中兔骨髓间充质干细胞的分化情况，观察染色结果。 三．诱导BrdU标记的人脐血间充质干细胞分化成软骨细胞方法由足月顺产分娩的新生儿脐静脉穿刺抽取脐带血，通过密度梯度法从脐带血中获得脐血间充质干细胞并体外培养，通过细胞计数统计细胞生长数量，统计数据应用SPSS13．0统计软件以单因素重复测量方法分析整个细胞生长周期各时间段是否存在显著性差异，总结细胞分化生长规律；用BrdU标记人脐血干细胞，采用Transwell技术将BrdU标记的人脐血干细胞与兔关节软骨细胞非接触式共培养，诱导人脐血干细胞分化为软骨细胞，并用免疫组化染色方法进行诱导后细胞类型鉴定。 四．同种异体兔骨髓间充质干细胞/小肠黏膜下层复合物修复兔耳廓缺损方法制备兔小肠黏膜下层；以TGF-β1诱导同种异体兔骨髓间充质干细胞生成的软骨细胞作为种子细胞，经过处理的同种异体兔片状小肠黏膜下层作为支架材料，将软骨细胞/小肠黏膜下层复合物在体外培养7d后种植于兔耳廓缺损处，分别于种植后4、10、16周于缺损区取材行大体观察和HE染色、甲苯胺蓝染色和Massons三色染色组织学观察，了解同种异体兔骨髓间充质干细胞/小肠黏膜下层复合物对兔耳廓缺损组织修复的情况。 五．同种异体骨髓间充质干细胞与丝素蛋白（SF）/壳聚糖（CS）大孔微载体复合物修复兔耳廓缺损方法将SF和CS按照一定比例混合，通过乳化-化学交联、冷冻干燥、极性溶液处理制成具有多孔结构的SF/CS大孔微载体；将同种异体骨髓间充质干细胞与SF/CS大孔微载体体外复合培养，倒置显微镜每日观察微载体材料上细胞生长情况，7d后植入兔耳廓缺损区，分别于8、12周取材行大体观察和HE染色、Massons三色染色组织学观察。 结果： 一．贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞，所得第3代骨髓间充质干细胞经诱导培养14d后细胞形态逐渐变为圆形、长菱形及三角形等不规则形状、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性的软骨细胞。 二．BrdU标记后的兔骨髓间质干细胞活细胞率在各时间段无显著性差异（P>0．05），说明BrdU标记时间的长短，对细胞的活性基本没有影响；兔骨髓间充质干细胞与兔软骨细胞非接触式分层培养诱导14d后，细胞胞浆被碱性磷酸酶染色染成典型的蓝紫色，细胞核被双染的DAB染色染成黄色，即Ⅱ型胶原免疫染色阳性的软骨细胞。 三．在体外培养环境下，脐带血间充质干细胞在一定时间内分化生长迅速，传代后7～13 d细胞处于对数生长期；16～19 d进入平台期，扩增速度快于原代培养，倍增时间为8．5 d；细胞周期细胞计数数据采用单因素重复测量方法分析显示细胞生长周期各组间存在显著差异（P<0．05），说明细胞增殖旺盛；Brdu标记的人脐带血间充质干细胞经兔软骨细胞诱导培养后分化形成的细胞，同正常兔软骨细胞一样，经碱性磷酸酶染色和抗Brdu抗体染色双染，细胞胞质被染成蓝紫色，细胞核表现为黄色，说明已被诱导后分化为软骨细胞。 四，同种异体兔骨髓间充质干细胞经TGF-β1诱导后形成的软骨细胞/小肠黏膜下层复合物植入体内后，第4周时镜下显示复合物周围有纤维组织形成包膜，新生组织内炎性细胞数量较多；随着时间延长，炎性细胞逐渐减少，软骨细胞数目和软骨基质成分逐渐增加；第10周时软骨陷窝明显，细胞基质增多，较第4周时软骨细胞增多；16周时植入区有软骨形成，小肠黏膜下层组织材料被完全吸收，经苏木精-伊红染色，Massan染色，甲苯胺兰染色检查证实为软骨组织，但修复层软骨较薄。 五．SF/CS大孔微载体表面呈多孔的海绵状球形结构，孔径为40-80μm；体外培养环境下，兔骨髓间充质干细胞能够黏附在微载体的孔壁上生长、繁殖，形成集落性细胞团；接种同种异体兔骨髓间充质干细胞的SF/CS大孔微载体复合物经体外培养7～10d后，植入兔耳廓缺损区，术后8周时镜下显示缺损区植入的复合物中有基质分泌旺盛、胞体较小的新生软骨细胞；术后12周时缺损区由新生软骨组织填充，新生软骨细胞接近成熟，但新生软骨组织较薄，部分区域填充不均匀。 结论： 一．在含有TGF-β1和转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠等成分的特殊软骨诱导体系培养条件下，骨髓间充质干细胞可以转化为免疫组化染色显示与正常人鼻中隔软骨细胞无明显差别的软骨细胞。 二．采用BrdU标记细胞的方式证明软骨细胞在体外可定向诱导分化骨髓间充质干细胞成软骨细胞；BrdU对标记细胞无毒副作用，对细胞增殖分化无影响，为组织工程化软骨的构建提供一种简单易行的标记方法。 三．采用BrdU标记的人脐血干细胞经过兔软骨细胞诱导以后可以分化成软骨细胞，这种方式为软骨缺损的组织工程修复提供了又一种软骨细胞来源。 四．经过处理的同种异体小肠黏膜下层与骨髓间充质干细胞经TGF-β1诱导后生成的软骨细胞在体外共培养生长，细胞生长良好，细胞相容性好；诱导后生成的同种异体软骨细胞/小肠黏膜下层复合物在动物体内能够形成新生软骨组织，并成功修复软骨缺损。 五．在体外，丝素蛋白/壳聚糖大孔微载体可与骨髓间充质干细胞共同生长，且细胞相容性良好；丝素蛋白/壳聚糖大孔微载体与同种异体骨髓间充质干细胞所形成的复合物植入有免疫力动物体内软骨缺损区可形成软骨组织并修复软骨缺损。 意义： 一．本研究建立了含有TGF-β1和转铁蛋白、胰岛素、丙酮酸钠等成分的特殊软骨诱导体系，并采用此体系将骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞。 二．本研究首先采用Brdu标记细胞的方式证明软骨细胞在体外可定向诱导分化骨髓间充质干细胞为软骨细胞的科学性、可行性；Brdu标记做为一种简单的标记方法可以更广泛地应用于组织工程明确细胞性质的研究中。 三．采用Brdu标记的人脐血干细胞经过软骨诱导以后可以分化成软骨细胞，这种方法为软骨缺损的组织工程修复、重建提供了又一软骨细胞来源，尚未见报导。 四．本研究证明经过处理的同种异体小肠黏膜下层与骨髓间充质干细胞经TGF-β1诱导后生成的软骨细胞在体外共培养生长，细胞生长良好，细胞相容性好；软骨细胞/小肠黏膜下层复合物在动物体内能够形成新生软骨组织，并成功修复软骨缺损，尚未见报导。 五．本研究利用丝素蛋白、壳聚糖这两种生物材料的优势和特色，制备丝素蛋白/壳聚糖大孔微载体，发现这种微载体可与骨髓间充质干细胞共同生长，并有良好细胞相容性；微载体与骨髓间充质干细胞所形成的复合物植入有免疫力动物体内软骨缺损区可形成软骨组织并修复软骨缺损，为组织工程方法修复软骨缺损及将来进一步应用到临床提供了一种新的材料来源及实验基础，尚未见报导。