【摘 要】
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本工作从牛瘤胃的富集培养物中提取未培养细菌的总DNA，用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建宏基因组文库，得到一个包含约8千个克隆的宏基因组文库。该文库外源片段最大为50.8kb，最小约20.5kb，平均大小为35.6kb，外源总DNA容量约为2.86×108bp。对文库进行活性筛选，获得1个表达既表达内切酶活性又表达4-MUC活性的克隆，对具有活性的克隆进行亚克隆、测序分析。鉴定分析表明：该克隆
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本工作从牛瘤胃的富集培养物中提取未培养细菌的总DNA，用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建宏基因组文库，得到一个包含约8千个克隆的宏基因组文库。该文库外源片段最大为50.8kb，最小约20.5kb，平均大小为35.6kb，外源总DNA容量约为2.86×108bp。对文库进行活性筛选，获得1个表达既表达内切酶活性又表达4-MUC活性的克隆，对具有活性的克隆进行亚克隆、测序分析。鉴定分析表明：该克隆上潜在的内切酶基因umce／5K具1个1002bp的ORF（Open Reading Frame），可编码含333个氨基酸的蛋白质。umce／5K蛋白与一个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶CelA（ABA02176）同源性最高，一致性为53％、相似性为68％；其次与来自混合纤维弧菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶CelA（AAB61461）一致性为51％、相似性为67％。将该ORF转入表达载体后用IPTG诱导表达Umcel 5K蛋白，经过Ni-NTA纯化后测定其酶学特性。Umcel 5K最适pH和最适温度分别为5.0和50℃。从Umcel 5K的pH耐受性和热稳定性实验中可知，Umcel 5K较适合偏酸酸性的环境，是个中温酶，不耐高温。其Km值为3.843mg／ml，Vmax为152.4U／mg。部分金属如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活，而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel 5K的活性影响不大。
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