环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究

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志贺氏菌(Shigella)是引起食物中毒的常见致病菌之一,引起食物中毒的食品多为肉类,乳制品等蛋白质含量多的食品。目前,国内检测食品中志贺氏菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间长,通常需要3~5 d。本研究建立了一套用LAMP技术快速检测志贺氏菌的方法,缩短了检测时间,提高检测方法的灵敏性。FTA卡是用螯合剂和变性剂浸泡过的纤维基质,他可以在接触微生物时将其吸附并裂解细胞,使DNA吸附在纤维基质上。FTA可以高效、快速、低损耗的提取DNA。本研究将FTA与环介导等温扩增(LAMP)方法相结合,检测志贺氏菌。本研究针对志贺氏菌的特异基因ipaH设计引物,用LAMP引物在线设计软件设计引物,对内引物浓度、外引物浓度、Mg2+浓度、Bst酶浓度等反应条件进行了优化,建立LAMP反应体系。LAMP反应体系如下:F3与B3(LAMP反应外引物)各0.2 mM; BIP与FIP (LAMP反应内引物)0.8 mM;其它反应组分终浓度分别为:0.3 mM dNTP, 0.3 mM MgCl2,2.5μL ThermoPol buffer(20 mM Tris-HCl (pH8.8, 25°C),10 mM KCl,10 mM (NH42SO4,2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100), 0.5μL (8U) Bst大分子聚合酶,1μL目标DNA,纯水补足体积到25μL。扩增反应条件为62℃保存1 h,80℃2 min使酶灭活。本研究通过LAMP方法检测纯菌液及人工污染猪肉对LAMP反应的最小检出限进行确定。结果表明:LAMP在反应过程中,能够产生大量的肉眼可见的焦磷酸镁沉淀。LAMP对菌悬液的最低检出浓度为62 CFU/mL,传统的PCR方法对菌悬液的最低检出浓度620 CFU/mL。LAMP对猪肉中志贺氏菌的最低检出量为42 CFU/mL。LAMP法扩增最短可在20min内完成,对猪肉中志贺氏菌的检测的整个检测过程(包括DNA提取1 h、LAMP反应30 min和电泳30 min)可在2 h内完成。初步建立LAMP检测志贺氏菌的快速检测方法,该方法灵敏度高、特异性好、耗时短,为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。
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