【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路在慢性1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine,MNNG）暴露诱导人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）向胃癌干细胞恶性转化中的调控机制以及SFN的干预作用,为研究N-亚硝基化合物诱导胃癌发生、发展和有效干预的分子机制提供重要的科学依据。方法:GES-1细胞经慢性MNNG暴露30代后得
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目的:本研究旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路在慢性1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine,MNNG）暴露诱导人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）向胃癌干细胞恶性转化中的调控机制以及SFN的干预作用,为研究N-亚硝基化合物诱导胃癌发生、发展和有效干预的分子机制提供重要的科学依据。方法:GES-1细胞经慢性MNNG暴露30代后得到TGES-1（Transformed GES-1）细胞;显微镜下观察诱导过程中细胞形态变化;软琼脂集落形成实验和平板克隆实验检测TGES-1细胞克隆形成能力;Transwell实验检测细胞侵袭转移能力;在无血清培养基（Serum-free medium,SFM）中,利用体外克隆成球法培养TGES-1细胞,分离富集胃癌干细胞,显微镜下观察TGES-1细胞悬浮成球能力变化;Western blot与q RT-PCR实验检测TGES-1细胞恶性相关分子、胃癌干细胞标志分子、Wnt/β-catenin信号通路相关分子的蛋白和m RNA表达水平。进一步利用体外克隆成球实验、Western blot、q RT-PCR实验研究SFN对TGES-1胃癌干细胞活性的抑制效应及机制。结果:1.慢性MNNG暴露诱导GES-1细胞发生恶性转化选取MNNG对GES-1无细胞毒性作用的浓度（0.1μM、0.5μM、1μM）连续处理30代,相应得到TGES-1-Ⅰ、TGES-1-Ⅱ、TGES-1-Ⅲ三个组,连续传代但无MNNG暴露的对照细胞标记为CGES-1。镜下观察各组细胞形态逐渐由纺锤形、圆形或卵石形变为梭形、扁平状或条索状;平板克隆实验和软琼脂集落形成实验显示TGES-1细胞克隆形成能力显著提高;Transwell实验显示TGES-1细胞侵袭转移能力增强;Western blot与q RT-PCR结果显示,TGES-1细胞上皮标志分子的蛋白和m RNA水平下降,间质标志分子表达增加。上述结果表明在我们的研究体系中已经成功建立慢性MNNG暴露诱导GES-1细胞向胃癌细胞恶性转化的模型,且TGES-1-Ⅲ组的恶性表型更为明显。2.TGES-1细胞具有胃癌干细胞活性TGES-1细胞在含特定生长因子的无血清培养液中呈细胞球样悬浮生长;与CGES-1细胞相比,无血清悬浮培养TGES-1清悬浮培养血清培养液中呈细胞体外克隆成球能力及胃癌干细胞标志分子蛋白表达显著增加,表明已成功建立TGES-1胃癌干细胞体外培养模型。3.Wnt/β-catenin信号通路调控TGES-1胃癌干细胞活性Western blot与q RT-PCR实验结果显示,TGES-1胃癌干细胞中Wnt/β-catenin通路被激活。Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939显著抑制TGES-1悬浮细胞球的数目和大小,并降低胃癌干细胞标志分子的表达水平,提示Wnt/β-catenin通路在维持TGES-1胃癌干细胞活性中发挥重要作用。4.莱菔硫烷抑制TGES-1胃癌干细胞活性SFN（0、1、5、15μM）可剂量依赖性地抑制悬浮细胞球的体积和数量,同时下调胃癌干细胞标志分子的蛋白表达水平,表明SFN可以显著抑制TGES-1胃癌干细胞的活性。5.莱菔硫烷通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制TGES-1胃癌干细胞活性SFN显著下调TGES-1胃癌干细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达;采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl能明显逆转SFN对TGES-1胃癌干细胞活性的抑制作用。以上结果表明,Wnt/β-catenin信号通路介导了SFN对TGES-1胃癌干细胞的抑制作用。结论:综上所述,Wnt/β-catenin信号通路在慢性MNNG暴露诱导人胃黏膜细胞细胞向胃癌干细胞恶性转化干预中起重要的调控作用。本研究结果为靶向作用于关键肿瘤相关分子、干预MNNG诱导胃癌的发生过程提供新的重要的科学依据,并对今后开展亚硝胺类致癌作用的同类研究提供新的研究策略。
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