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犬细小病毒病(Canineparvovirusdisease,CPVD)是犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)导致犬类以出血性肠炎、心肌炎为主要症状并伴随白细胞减少、呕吐、腹泻现象的一种急性高度接触性传染病。CPV可通过消化道感染，各年龄和品种的犬均可感染，传播速度快，发病率和死亡率高，是犬类主要急性传染病之一，严重影响家养宠物的健康，并对养犬业带来特大经济损失。犬细小病毒病的市售疫苗主要为灭活苗和弱毒苗，且以多联苗为主，具有较好的免疫效果。CPV具有一定的变异性，所以选择的CPV弱毒疫苗也可能存在一定的抗原变异性。免疫接种口服疫苗，没有抗原变异的危险，操作安全、简单、方便。病毒样颗粒(viruslikeparticles,VLPs)模拟天然病毒粒子结构，低剂量即可诱导机体产生高效免疫。 针对CPV的主要感染途径及其肠道致病和黏膜免疫的特点，以乳酸菌为载体，设计CPV病毒样粒子口服疫苗。活载体乳酸菌可激发机体免疫反应。本研究以乳酸乳球菌为递呈抗原的载体，利用乳酸菌表达系统表达CPVVP2蛋白。进一步证实CPVVLPs体外组装能力及其免疫原性，是犬细小病毒基因疫苗的一次新的尝试。 为研究乳酸菌表达犬细小病毒VP2蛋白的可行性，本试验将CPV的VP2目的基因克隆至乳酸菌表达载体pMG36e，电转化至乳酸乳球菌MG1363。菌液PCR及酶切鉴定正确，提取质粒测序，基因序列与CPV-2a型标准毒株的同源性为99%，测序分析结果正确，成功构建重组表达载体pMG36e-VP2，且成功转化至乳酸菌。重组乳酸菌经诱导表达、蛋白纯化后SDS-PAGE和WesternBlot鉴定，获得蛋白分子大小正确的VP2蛋白，此蛋白与犬源CPV阳性血清发生特异反应，有良好免疫反应性。本试验成功获得表达VP2蛋白的重组乳酸菌，为后续进行重组乳酸菌的免疫原性分析提供科学基础。 为确定犬细小病毒VLPs的包装情况，电镜下观察，有与天然CPV粒子相似的空心粒子，确认是犬细小病毒VLPs。为鉴定前期构建的重组乳酸菌的临床效果，测定重组乳酸菌的免疫效果及其抗体水平。以小鼠建立动物模型，通过口服和腹腔注射途径免疫小鼠重组乳酸菌，间接ELISA检测小鼠抗体效价，结果证明免疫重组乳酸菌小鼠的抗体变化规律与免疫CPV弱毒疫苗的相似；且抗体效价明显高于空白对照，差异极显著（P<0.01）。采用HI试验检测小鼠的血清抗体水平，结果表明重组乳酸菌在小鼠体内的总体免疫原性良好。收集小鼠粪便培养细菌，经菌液PCR及双酶切鉴定，所收集得到的细菌为重组乳酸菌。观测菌落生长情况，表明免疫后15d内粪便中可持续检测到重组乳酸菌，一定时期内，肠道中乳酸菌定植情况递减，须定期免疫。 综上所述，本研究成功构建了犬细小病毒VP2基因的乳酸菌表达载体，并在乳酸乳球菌MG1363中得到了高效表达，该VP2蛋白表达正确，且具有与犬源多克隆抗体的反应原性，在体外环境可自组装成类似天然犬细小病毒粒子的病毒样颗粒，并能有效刺激小鼠的体内的免疫反应。包含VP2蛋白的重组乳酸菌可在小鼠肠道内定植，并能够产生黏膜免疫反应，这为新型、安全、高效的CPV病毒样粒子口服疫苗开发和应用提供了新的思路。