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PDCoV是新发现的一种能引起仔猪腹泻、呕吐和脱水等临床症状的δ冠状病毒科成员，2012年Woo等首次在猪粪便样品中检测出PDCoV，且2014年PDCoV病在美国猪群中爆发。目前，对PDCoV的研究主要集中在病毒的分离鉴定和抗原检测等方面，对PDCoV的起源、宿主谱和感染机制等尚不清楚，且该病毒出现跨宿主传播的可能性，引起人们的广泛关注。PDCoV是新发现的一种冠状病毒，目前尚无标准化的诊断试剂盒，因此建立快速、高效和特异的PDCoV的诊断方法是目前所急需的。本研究利用M蛋白和S1蛋白建立了间接ELISA检测方法，并与实验室已建立的N蛋白ELISA检测方法进行比较研究，以寻得一种针对PDCoV血清敏感性较好的检测方法，应用于临床血清的大量检测。具体研究如下:
1.PDCoV M蛋白的原核表达及PDCoV-M-ELISA方法的建立
为建立检测PDCoV M蛋白抗体的间接ELISA方法，本研究从新分离的PDCoV HNZK-04株中扩增M基因并克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组表达质粒pET-32a-PDCoV-M。将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃条件下加入一定浓度的IPTG进行诱导使该蛋白得到高效表达，所表达的目的蛋白相对分子质量约41KD，Western Blot显示PDCoV阳性血清能与该蛋白发生特异性反应。将该蛋白纯化后作为包被抗原，建立了PDCoV-M-ELISA的检测方法。利用方阵法确定抗原的包被浓度是1μg/mL，在37℃1h+4℃12h的条件下包被抗原;5％BSA在37℃封闭2h;一抗80倍稀释后，37℃反应1h;二抗8000倍稀释后，37℃反应45min;TMB在37℃显色15min;临床血清的临界值为0.300。特异性试验显示该包被抗原与其它猪常见病毒(PEDV、TGEV、HCV、PRV、PRRSV、PCV2)的阳性血清都无交叉反应;批内重复试验和批间重复试验变异系数分别为0.931％～3.092％和0.832％～8.286％。综上所述成功表达了PDCoV M蛋白，建立了PDCoV-M-ELISA检测方法且该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性。
2.PDCoV-S1-ELISA方法的建立
为建立检测PDCoV S1蛋白抗体的间接ELISA方法，本试验利用实验室制备好的S1蛋白，按照方阵法建立了PDCoV-S1-ELISA检测方法。通过对各种条件的优化，PDCoV-S1-ELISA方法步骤如下:抗原0.5μg/mL在4℃过夜包被;0.05g/mL脱脂奶在37℃封闭2h;一抗160稀释后，在37℃反应1h;二抗8000稀释后，37℃反应45min;TMB在37℃显色10min;临床血清OD450值≥0.309判定为阳性。特异性试验显示，该包被抗原与其它猪常见病毒的阳性血清都无交叉反应;批内重复试验结果变异系数在1.975％～5.303％之间，批间重复试验结果变异系数在2.797％～6.077％，说明PDCoV-S1-ELISA方法特异性重复性良好。
3.三种ELISA方法对PDCoV感染临床猪血清敏感度与符合度的比较
利用三种ELISA检测方法对PDCoV感染猪血清符合程度和敏感性进行比较，以期找到一种灵敏度较好的检测方法。本试验通过PDCoV-M-ELISA、PDCoV-S1-ELISA和已建好PDCoV-N-ELISA三种ELISA检测方法对67份临床猪血清样本进行检测。结果显示PDCoV-N-ELISA方法检测阳性血清为55份，血清阳性率为82.09％;PDCoV-M-ELISA方法检测阳性血清为52份，血清阳性率为77.61％;PDCoV-S1-ELISA方法检测阳性血清为46份，血清阳性率为68.66％。从三种方法检出的阳性率可以看出，N蛋白敏感性比较好。由于目前没有该对该病毒进行检测的标准化试剂盒，故本试验以PDCoV-N-ELISA为基准，对其他两种ELISA方法进行评估。从敏感性来说，PDCoV-S1-ELISA试验对PDCoV-N-ELISA试验的敏感性为83.64％。PDCoV-M-ELISA试验对PDCoV-N-ELI SA试验的敏感性为94.55％。从符合度来说，PDCoV-S1-ELISA试验对PDCoV-N-ELISA试验的符合度为0.41，为中度符合。PDCoV-M-ELISA试验对PDCoV-N-ELI SA试验符合度为0.77，为高度符合。从本试验的结果来看，N蛋白建立的ELISA方法对猪感染PDCoV敏感性更好。三种ELISA检测方法的比较，为检测试剂盒的开发有非常重要的意义。
4.PDCoV在河南省临床猪血清中的感染情况
为了解PDCoV在河南省临床猪血清中的感染情况，本试验利用灵敏度较好的PDCoV-N-ELISA方法，对2016～2018年河南省17个地区131个不同规模猪场送检的2902份临床猪腹泻血清样本进行PDCoV IgG抗体的检测。结果显示2902份临床猪血清总阳性率为61.41％;从2016～2018三年的感染情况来看，2017年的血清阳性率最高为63.39％(1091/1921)，2016年的血清阳性率最低为55.17％(51/92);从河南省不同地区来看，各地区血清样本PDCoV抗体阳性率介于42.5％～84.72％之间，平均为61.41％，其中信阳地区的阳性率最高达到84.72％(61/72)，三门峡地区的阳性率最低为42.5％(17/40)，说明PDCoVIgG抗体在河南省不同地区的流行差异较大;从不同季节来看，该病毒在寒冷季节的感染情况比较严重，血清阳性率为71.97％（778/1081），在炎热季节的血清阳性率最低为44.23％(161/364);从不同种类猪群来看，每个年龄段的猪血清中均可检测到PDCoVIgG抗体，说明PDCoV可以感染不同生长阶段的猪群，虽然在临床上PDCoV主要引起仔猪腹泻，但是也要做好其他年龄段猪的防控措施。从不同养殖规模来看，不同规模的养殖场PDCoV IgG抗体的感染情况差别不大。说明PDCoV在临床猪血清中的感染情况比较严重。
1.PDCoV M蛋白的原核表达及PDCoV-M-ELISA方法的建立
为建立检测PDCoV M蛋白抗体的间接ELISA方法，本研究从新分离的PDCoV HNZK-04株中扩增M基因并克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组表达质粒pET-32a-PDCoV-M。将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃条件下加入一定浓度的IPTG进行诱导使该蛋白得到高效表达，所表达的目的蛋白相对分子质量约41KD，Western Blot显示PDCoV阳性血清能与该蛋白发生特异性反应。将该蛋白纯化后作为包被抗原，建立了PDCoV-M-ELISA的检测方法。利用方阵法确定抗原的包被浓度是1μg/mL，在37℃1h+4℃12h的条件下包被抗原;5％BSA在37℃封闭2h;一抗80倍稀释后，37℃反应1h;二抗8000倍稀释后，37℃反应45min;TMB在37℃显色15min;临床血清的临界值为0.300。特异性试验显示该包被抗原与其它猪常见病毒(PEDV、TGEV、HCV、PRV、PRRSV、PCV2)的阳性血清都无交叉反应;批内重复试验和批间重复试验变异系数分别为0.931％～3.092％和0.832％～8.286％。综上所述成功表达了PDCoV M蛋白，建立了PDCoV-M-ELISA检测方法且该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性。
2.PDCoV-S1-ELISA方法的建立
为建立检测PDCoV S1蛋白抗体的间接ELISA方法，本试验利用实验室制备好的S1蛋白，按照方阵法建立了PDCoV-S1-ELISA检测方法。通过对各种条件的优化，PDCoV-S1-ELISA方法步骤如下:抗原0.5μg/mL在4℃过夜包被;0.05g/mL脱脂奶在37℃封闭2h;一抗160稀释后，在37℃反应1h;二抗8000稀释后，37℃反应45min;TMB在37℃显色10min;临床血清OD450值≥0.309判定为阳性。特异性试验显示，该包被抗原与其它猪常见病毒的阳性血清都无交叉反应;批内重复试验结果变异系数在1.975％～5.303％之间，批间重复试验结果变异系数在2.797％～6.077％，说明PDCoV-S1-ELISA方法特异性重复性良好。
3.三种ELISA方法对PDCoV感染临床猪血清敏感度与符合度的比较
利用三种ELISA检测方法对PDCoV感染猪血清符合程度和敏感性进行比较，以期找到一种灵敏度较好的检测方法。本试验通过PDCoV-M-ELISA、PDCoV-S1-ELISA和已建好PDCoV-N-ELISA三种ELISA检测方法对67份临床猪血清样本进行检测。结果显示PDCoV-N-ELISA方法检测阳性血清为55份，血清阳性率为82.09％;PDCoV-M-ELISA方法检测阳性血清为52份，血清阳性率为77.61％;PDCoV-S1-ELISA方法检测阳性血清为46份，血清阳性率为68.66％。从三种方法检出的阳性率可以看出，N蛋白敏感性比较好。由于目前没有该对该病毒进行检测的标准化试剂盒，故本试验以PDCoV-N-ELISA为基准，对其他两种ELISA方法进行评估。从敏感性来说，PDCoV-S1-ELISA试验对PDCoV-N-ELISA试验的敏感性为83.64％。PDCoV-M-ELISA试验对PDCoV-N-ELI SA试验的敏感性为94.55％。从符合度来说，PDCoV-S1-ELISA试验对PDCoV-N-ELISA试验的符合度为0.41，为中度符合。PDCoV-M-ELISA试验对PDCoV-N-ELI SA试验符合度为0.77，为高度符合。从本试验的结果来看，N蛋白建立的ELISA方法对猪感染PDCoV敏感性更好。三种ELISA检测方法的比较，为检测试剂盒的开发有非常重要的意义。
4.PDCoV在河南省临床猪血清中的感染情况
为了解PDCoV在河南省临床猪血清中的感染情况，本试验利用灵敏度较好的PDCoV-N-ELISA方法，对2016～2018年河南省17个地区131个不同规模猪场送检的2902份临床猪腹泻血清样本进行PDCoV IgG抗体的检测。结果显示2902份临床猪血清总阳性率为61.41％;从2016～2018三年的感染情况来看，2017年的血清阳性率最高为63.39％(1091/1921)，2016年的血清阳性率最低为55.17％(51/92);从河南省不同地区来看，各地区血清样本PDCoV抗体阳性率介于42.5％～84.72％之间，平均为61.41％，其中信阳地区的阳性率最高达到84.72％(61/72)，三门峡地区的阳性率最低为42.5％(17/40)，说明PDCoVIgG抗体在河南省不同地区的流行差异较大;从不同季节来看，该病毒在寒冷季节的感染情况比较严重，血清阳性率为71.97％（778/1081），在炎热季节的血清阳性率最低为44.23％(161/364);从不同种类猪群来看，每个年龄段的猪血清中均可检测到PDCoVIgG抗体，说明PDCoV可以感染不同生长阶段的猪群，虽然在临床上PDCoV主要引起仔猪腹泻，但是也要做好其他年龄段猪的防控措施。从不同养殖规模来看，不同规模的养殖场PDCoV IgG抗体的感染情况差别不大。说明PDCoV在临床猪血清中的感染情况比较严重。