非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外病毒、药物、酒精等因素,主要由代谢因素引起的一系列疾病谱,包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关性肝纤维化、肝硬化,甚至相关性肝癌。“二次打击”学说是目前最广为接受的关于NAFLD的发病机制学说。第一次打击是指胰岛素抵抗并导致大量的脂质如甘油三酯在胞浆内的堆积,第二次打击则主要指氧化应激。最近的研究提示内质网应激可能在NAFLD中起到了重要的作用。我们之前在体实验也证实了内质网应激可促使非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)转化。但是肝细胞内脂质的增多是如何激发内质网应激的并不清楚。也就是说,找到脂毒性启动ERS的方式具有重要意义。内质网是具有脂质合成、蛋白质翻译合成以及钙离子贮存等功能,是胞内重要的细胞器。细胞脂肪变发生时,脂滴首先在内质网内合成,然后以“出芽”的方式进入胞浆内。主要表达于内质网膜上的Sigma-1受体(Sigma-1R)参与了内质网脂滴出芽的过程。有研究通过外界干扰的手段,发现Sigma-1R的静默表达可导致脂质堆积在内质网中,造成内质网内环境紊乱并发生进行性病变。这些线索提示:在NAFLD发生发展过程中,Sigma-1R可能是细胞内脂质堆积潜在的打击靶点,但目前尚无Sigma-1R与NAFLD之间关系的研究。因此,本研究目的在于明确NAFLD中Sigma-1R的表达变化及初步探讨其意义。方法:1.通过在培养基中加入软酯酸钠建立了肝细胞脂肪变的体外模型。2.应用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HepG2细胞,当细胞汇合度达到80%以上,所有培养皿中的细胞进行胎牛血清剥夺过夜。然后将对照组(0h组)用DMEM加1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白培养。模型组用DMEM加1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白加500μM(微摩尔/升)的软脂酸钠进行培养。根据诱导脂肪变的时间,模型组分为2h组、4h组、8h组和12h组。3.尼罗红染色显示胞内脂滴,利用激光共聚焦显微镜观察细胞脂肪变程度。4.利用Real-time PCR检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及Sigma-1受体(Sigma-1R)的mRNA水平的表达。5.利用western-blot检测GRP78和Sigma-1R在蛋白水平上的表达变化。6.利用MTT法检测各组细胞在脂肪变诱导后的细胞活性。7.利用SPSS软件,对Sigma-1R蛋白水平与GRP78蛋白水平、Sigma-1R蛋白水平与细胞活性以及GRP78蛋白水平与细胞活性进行相关性分析。结果:1.尼罗红染色评价脂肪变程度在500μM软脂酸钠的作用下,HepG2细胞被成功地诱导发生了脂肪变。尼罗红染色后脂滴在胞浆内呈现为红色的原点。利用IPP6.0软件进行图像分析处理,发现每个细胞的平均脂变面积随诱导时间延长而增加。12h组的平均脂变面积达到435.14±39.87像素,明显高于正常对照组(P<0.01)。2. Real-time PCR检测GRP78和Sigma-1R的mRNA水平表达情况GRP78的mRNA水平在8h组和12h组高于0h组(P<0.05)。Sigma-1R的mRNA水平从脂肪变诱导2小时后即开始出现下降,即是说2h组细胞的Sigma-1R在mRNA水平上较0h组明显下调(P<0.05)。3. Western blot检测GRP78和Sigma-1R的蛋白表达水平8h组和12h组的GRP78蛋白表达水平较0h组明显升高(P<0.05),与其mRNA水平表达趋势一致。然而,Sigma-1R的蛋白水平在诱导8小时后才出现,晚于其mRNA水平的下降。8h组和12h组的Sigma-1R蛋白水平较0h组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4. MTT检测细胞活性MTT检测提示细胞活性在细胞脂肪变性加重过程中逐渐下降,12h组细胞活性率在59.86±4.47%,较0h组明显降低(P<0.05)。5.相关性分析结果相关性分析结果提示Sigma-1R蛋白水平与GRP78蛋白水平呈负相关(r= -0.932,P<0.01),Sigma-1R蛋白水平与细胞活性呈正相关(r=0.815,P<0.05),GRP78蛋白水平与细胞活性呈负相关(r=-0.822,P<0.05)。结论:1.肝细胞脂肪变体外模型可应用软脂酸诱导构建,细胞脂肪变程度随诱导时间延长而增长。2.细胞脂肪变过程中,Sigma-1R在诱导早期就开始出现mRNA水平的下降,而其蛋白水平的下降发生在诱导后期。在脂肪变诱导后期,GRP78在mRNA和蛋白水平的表达都明显上升,它的过度表达表明内质网应激的发生,导致此时期细胞明显损伤。3. Sigma-1R可能是脂肪酸堆积这一应激因素早期打击的靶点。Sigma-1R的下调可诱导内质网应激的发生,并进一步导致细胞死亡。