柿(Diospyros kaki Linn.)是我国重要的果树树种之一,根据脱涩的难易程度,可分为甜柿和涩柿两大类。涩柿原产于我国,资源丰富,具有丰产、抗性强、品质优、耐贮运等特点,是世界栽培数量最大的类型。‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn. cv. Nantongxiaofangshi)(当地俗称小方柿)是江苏省南通地区的著名地方品种,现有栽培面积10万余亩。该品种具有树体矮小、早果、丰产稳产、无核、质优、易脱涩等特点,是我国珍贵的矮生型柿子种质资源。可溶性单宁是柿果实呈现涩味的主要原因,涩柿果实中可溶性单宁含量较高,需脱涩后才适合食用,而脱涩的过程主要是可溶性单宁转变成不溶性单宁的过程。乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenas,ADH)是催化乙醇形成乙醛的关键酶之一,同时也可以催化可溶性单宁与乙醛聚合形成不可溶性单宁,进而达到柿果脱涩的效果。本研究以‘南通小方柿’果实为材料,采用同源克隆和3’Race方法,从‘南通小方柿’中克隆了ADH1基因,并将该基因命名为DkADH1。通过生物信息学分析和表达分析,初步鉴定了该基因的特性和在不同组织中的表达模式,同时构建了该基因的植物表达载体,转入模式植物番茄中,进一步研究了该基因的功能。主要研究结果如下：1.以‘南通小方柿’果实为材料,通过同源克隆扩增出1377bp的ADH1基因,命名为DkADH1。其开放阅读框为1137个核苷酸,编码379个氨基酸。编码蛋白分子质量约为41kD,理论等电点PI为6.08,该编码蛋白无跨膜区,无明显的亲疏水性,它具有ADH基因典型的结构域和功能域。通过构建系统进化树,分析不同物种ADH基因间的进化关系。结果表明：‘南通小方柿’DkADH1基因与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性关系较近。2.以‘南通小方柿’不同发育时期果实和不同组织为材料,采用qRT-PCR进行了DkADH1基因及单宁生物合成途径中的相关基因的表达分析,同时测定了不同时期果实的单宁含量。结果表明：‘南通小方柿’在果实生长发育过程中,可溶性单宁含量呈现先升高,至7月12日达到最高值10.932mg/g,以后逐渐下降的趋势,而不溶性单宁含量在整个果实发育后期内则呈现逐渐增加的趋势。研究结果还表明：在‘南通小方柿’果实发育过程中,DkADH1基因表达水平呈现明显升高的趋势,同时单宁生物合成途径中的DkF3’5’H、DkDFR、DkPAL、DkLAR、DkDHD/SDH、DkMYB4等基因表达量则呈现下降趋势,维持在较低表达水平上,推测这些基因的表达可能是受DkADH1基因的影响。在‘南通小方柿’树体的茎、叶、花、叶柄、枝皮、果皮,果肉等不同组织中,DkADH1基因表达量依次顺序是果皮>叶片>果肉>枝皮>茎>叶柄>花,在果皮组织中最高,说明该基因具有组织特异性表达。3.用30%乙醇处理‘南通小方柿’成熟早期果实,在4天后完成脱涩,其果实中可溶性单宁含量迅速下降,与此同时不溶性单宁含量迅速上升。DkADH1基因表达分析显示：随着乙醇处理果实时间的延长,其表达水平也逐渐升高,说明该基因的表达能够促进可溶性单宁向不溶性单宁的快速转化。同时我们对乙醇处理后柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkPAL、DkF3’5’H、DkMYB4在果实中表达量也进行了定量分析,发现这些基因的表达量随着乙醇处理果实时间的延长,表达量呈迅速下降趋势。由此我们推测这些基因的表达可能主要受DkADH1基因的负调控。可见DkADH1基因一方面能够促进柿果实可溶性单宁向不溶性单宁转化,另一方面还可以调控单宁合成途径中相关基因的表达,减缓果实中单宁合成的速度,降低果实可溶性单宁含量。4.构建了DkADH1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法将DkADH1基因成功转入番茄中,通过PCR和RT-PCR进行检测,获得了3个转基因株系。以转基因番茄株系和非转基因对照植株为材料,测定番茄不同组织中单宁含量。结果表明：转基因番茄株系的叶片、花、果实中的单宁含量均显著低于非转基因番茄植株,说明该基因的转入抑制了番茄植物组织中单宁的合成。实验进一步分析了原花色素合成途径中F3’5’H、MYB和PAL基因的表达情况,结果表明DkADH1基因在转基因株系的过量表达,明显抑制了F3’5’H、MYB和PAL基因表达,这可能是转基因株系中各组织单宁含量降低的主要原因。因此我们推测DkADH1基因在南通小方柿果实脱涩过程中具有重要的功能。