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糖过量摄取所引起的肥胖症和糖尿病等公众健康问题日益严重,低卡路里天然甜味剂的开发成为热点。甜菊糖具有高甜度、低热能及健康辅助功能已作为“世界第三蔗糖”开发。甜菊苷(Stevioside和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖含量最丰富的两种成分,分别占干叶重的5-10%和2-4%。莱鲍迪苷A甜度最高,稳定性和水溶性较好,且不带有甜菊苷的苦涩味,具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法主要有:培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性等,但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)UGT76G1已报道可特异性催化甜菊糖中含量高、苦涩味重的甜菊苷生成莱鲍迪苷A。然而,甜叶菊中天然UGT76G1含量甚微,分离纯化成本高,难以获取大量的酶蛋白,并且在这个一步糖基化反应中需要昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作为糖基供体,必然导致RA酶促合成应用的经济性差。为了解决底物昂贵的问题,已经有研究发现了一种蔗糖合成酶SUS能催化蔗糖和UDP生成UDPG和果糖。蔗糖作为来源丰富的双糖,是一种理想的糖基供体,通过蔗糖合成酶催化蔗糖和UDP产生UDP-葡萄糖,有效地为NDP-糖基转移酶提供了NDP-糖的需求。UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶的级联反应催化体系为甜菊糖苷及其衍生物的商业化生产提供了新途径。本研究通过密码子优化及全基因合成的方法获得UDP-糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合成酶mb SU基因。实现UGT76G1和mb SUS在毕赤酵母GS115的胞内表达。重组酵母菌株GS115/p PIC9K-U76、GS115/p PIC9K/p PICZA-mb经甲醇诱导,摇瓶发酵120 h,测定UGT76G1的酶活为141.22U/g,蔗糖合成酶mb SUS的酶活为121.39U/g。通过这两个酶体外偶联构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷合成莱鲍迪苷A,有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用,在此基础,优化两个酶的体外酶量添加配比,研究发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U(UGT76G1):U(mb SUS)=6:1为合成RA的最佳酶活比例,在此条件下,可将10 m M ST转化合成8.20±0.11 m M RA,RA的产率达到82.91%。在确定UGT76G1和mb SUS在毕赤酵母细胞中胞内表达效率后,研究进一步构建了糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶mb SUS共表达的重组毕赤酵母菌株GS115(U76/mb1:1)(K1S1),实现了全细胞催化级联反应,双酶共表达重组菌株全细胞催化反应体系可在3h内催化10 m M ST合成6.44 m M RA,ST的转化率达到65.11%。并在此基础上利用多拷贝串联表达盒的方法,构建得到多拷贝双酶共表达重组毕赤酵母。本研究构建了GS115(U76/mb1:1)(K1S1)、GS115(U76/mb2:1)(K2S1)、GS115(U76/mb3:1)(K3S1)、GS115(U76/mb1:2)(K1S2)四株多拷贝双酶共表达重组毕赤酵母菌株,其中筛选得到催化能力最强的是重组菌株GS115(U76/mb3:1)(K3S1),此重组菌株经甲醇诱导发酵120 h,利用菌体全细胞催化反应3 h,可催化10 m M ST转化为9.75m M RA,ST的转化率达到99.19%,比单拷贝共表达菌株K1S1的转化效率提高了25.97%。