硒蛋白(selenomethionyl protein)是以硒代甲硫氨酸取代蛋白质中的甲硫氨酸形成的含硒蛋白,是一种在结构生物学常用的蛋白标记方法,能够有效解决蛋白晶体学中产生的相位问题(phase problem)。将大肠杆菌(Escherichia coli)培养在含有硒代甲硫氨酸的培养基中,是获得硒代甲硫氨酸标记蛋白的常规方法。由于大肠杆菌缺乏糖基化等翻译后修饰系统(post-translational modification system),因此难以用该方法表达研究真核蛋白的三维结构。酵母作为低等的真核生物,适合用来表达真核蛋白。但由于硒代甲硫氨酸的毒性,细胞难以在含硒代甲硫氨酸的培养基中生长,所以硒代甲硫氨酸对甲硫氨酸(methionine,Met)残基的取代率受到限制。虽然硒代甲硫氨酸的细胞毒性产生机制尚有争议,但是可能主要是由于细胞内的酶反应,通过含硫氨基酸生物合成途径以硒代甲硫氨酸为底物合成硒代半胱氨酸(selenocysteine),从而对细胞产生毒性。基于对硒代甲硫氨酸具有抗性的菌株的获得,我们对毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径进行了详细研究。毕赤酵母作为一种重要的工业表达菌株,其含硫氨基酸生物合成途径鲜有报道。为了研究毕赤酵母的含硫氨基酸合成途径,本研究首先采用生物信息学的方法对毕赤酵母基因组序列进行分析,结果揭示毕赤酵母中可能存在两条利用无机硫合成含硫氨基酸的生物合成途径:(1)还原态的无机硫S2-与O-乙酰同型丝氨酸(O-acetyl-homoserine)合成甲硫氨酸及半胱氨酸的前体物质同型半胱氨酸(homocysteine)。(2)还原态的无机硫S2-与O-乙酰丝氨酸(O-acetyl-serine)合成半胱氨酸(cystenine)。另外,在毕赤酵母(Pichia pastoris)基因组中还发现了与甲硫氨酸与半胱氨酸之间相互转化有关的基因。为了进一步验证毕赤酵母是否具有上述途径,本研究采用标准的毕赤酵母基因操作方法,通过系统的敲除目标基因得到了一系列单突变或者双突变型菌株并验证生长表型。结果表明毕赤酵母存在以O-乙酰同型丝氨酸为主的同型半胱氨酸合成途径,以及以O-乙酰丝氨酸为主的半胱氨酸合成途径。同时基因分析及缺陷型菌株表型验证的结果证明了甲硫氨酸与半胱氨酸之间的相互转化。另外,通过基因工程技术敲除PpCYS3基因,阻断硒代甲硫氨酸与硒代半胱氨酸之间的转化途径,成功获得了硒代甲硫氨酸抗性菌株Ppcys3Δ。利用不同浓度的硒代甲硫氨酸培养Ppcys3Δ抗性菌株,结果表明当硒代甲硫氨酸的浓度达到8mM时野生型细胞生长速率为零,而Ppcys3Δ的生长速率接近于60%。另外,通过向甲硫氨酸与半胱氨酸缺陷型培养基中补充1mM的半胱氨酸能够有效的抑制硒代甲硫氨酸的细胞毒性。