【摘 要】
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目的:本文主要研究目标为寻找慢性萎缩性胃炎“炎-癌”转化相关的关键微小RNA（micro NA,miRNA）分子,并探讨具有临床疗效的健脾清热活血方通过调控关键分子治疗慢性萎缩性胃炎、阻断“炎-癌”转化的可能机制。方法:1.本部分研究以miRNA为目标分子,采集胃“炎-癌”不同病理阶段的人胃黏膜标本（CNAG）,共20例样品进行高通量二代测序筛选慢性萎缩性胃炎“炎-癌”相关差异表达的miRNA,应
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目的:本文主要研究目标为寻找慢性萎缩性胃炎“炎-癌”转化相关的关键微小RNA（micro NA,miRNA）分子,并探讨具有临床疗效的健脾清热活血方通过调控关键分子治疗慢性萎缩性胃炎、阻断“炎-癌”转化的可能机制。方法:1.本部分研究以miRNA为目标分子,采集胃“炎-癌”不同病理阶段的人胃黏膜标本（CNAG）,共20例样品进行高通量二代测序筛选慢性萎缩性胃炎“炎-癌”相关差异表达的miRNA,应用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）对高通量第二代测序及临床验证的miRNA数据进行分析,筛选出miRNA潜在靶向作用的m RNA模块。以Funrich V3.0进行分子功能富集分析及蛋白互作分子。在此基础上,使用miRDB、miRTar Base、Target Scan数据库预测miRNA能靶向作用的m RNA。2.根据高通量二代测序结果筛选慢性萎缩性胃炎“炎-癌”转化的关键miRNA,在胃“炎-癌”四个病例阶段（慢性非萎缩性胃炎,慢性萎缩性胃炎,胃癌前病变,胃腺癌）共47例人胃黏膜样品中采用荧光实时定量PCR技术进行验证。明确关键miRNA在胃“炎-癌”转化中的变化趋势。3.在本团队前期完成健脾清热活血方治疗慢性萎缩性胃炎有效性验证的基础上,以治疗前、后的受试者为研究对象,应用q RT-PCR技术检测胃黏膜中关键miRNA表达水平的差异变化,探讨胃萎清颗粒及叶酸片对其的干预作用,以此初步探讨健脾清热活血治疗慢性萎缩性胃炎,阻断“炎-癌”转化的可能机制。结果:1.通过高通量二代测序技术检测20例胃“炎-癌”过程不同病理的受试者胃黏膜标本,筛选胃“炎-癌”发展及癌变相关的miRNA共2194个。使用DEseq2算法进行差异miRNAs的筛选,筛选出3个胃“炎-癌”转化差异表达显著的miRNA:miRNA196a-5p,miRNA552-5p,miRNA378i。2.对47例“炎-癌”不同病理阶段的人胃黏膜标本的荧光定量PCR检测,初步验证3个miRNA在“炎-癌”转化的作用。胃“炎-癌”不同病理阶段的人胃黏膜标本的q RT-PCR结果显示,miRNA196a-5p在慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃癌前病变、胃腺癌四个病理阶段表达呈非正态分布,2-△△Ct中位数分别为19.27-17.71-34.67-31.00。整体表达水平呈差异性上升趋势,组间存在统计学差异（P<0.05）,其中CNAG与PLGC,CNAG与GAC,CAG与PLGC,CAG与GAC组间具有显著差异（P<0.05）。提示miR-196a-5p在慢性萎缩性胃炎“炎-癌”转化中的重要作用。使用miRDB、miRTar Base、Target Scan数据库预测miR-195a-6p能靶向作用的m RNA,以上预测数据取交集获得miR-195a-6p最有可能靶向调控的m RNA:ACER23.共收集健脾清热活血方治疗前后25例受试者胃黏膜,治疗前后miRNA196a-5p变化水平不符合正态分布（P<0.05）,采用秩和检验。治疗前miRNA196a-5p的2-△△Ct中位数值为0.795,治疗后miRNA196a-5p的2-△△Ct中位数值为0.600,不存在统计学差异（p=0.367）。共收集叶酸片治疗前后5例受试者胃黏膜。治疗前后miRNA196a-5p变化水平不符合正态分布（P<0.05）,采用秩和检验。治疗前miRNA196a-5p的2-△△Ct值为0.459,治疗后miRNA196a-5p的2-△△Ct值为1.23,不存在统计学差异（P=0.345）结论:本研究发现miRNA196a-5p/ACER2通路为胃炎癌转化的关键通路,miRNA196a-5p可能通过下调ACER2水平损伤保护性自噬,从而促进胃“炎-癌”转化。本研究发现健脾清热活血方治疗前后miRNA196a-5p水平有所下降,提示健脾清热活血方可能是通过该通路延缓或阻断胃炎癌转化的过程。然而本研究仍有局限,在治疗前后miRNA196a-5p虽有所下降但缺乏统计学差异。可能与样本量较少、中药治疗的多靶点作用、治疗前后未配对有关。可围绕该关键miRNA设计临床研究进一步验证健脾清热活血方的可能治疗机制。
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