【摘 要】
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作为补体系统是唯一的抑制物,C1抑制物（C1INH）的N-端氨基酸能与LPS结合,对内毒素血症以及内毒素休克具有积极的治疗意义。实验前期工作：检测了C1INH N-端1至59氨基酸片段与LPS的结合能力,然后根据其N-端1至59氨基酸序列,设计了7条短肽,经ELISA检测它们与LPS的结合能力,发现其N-端18至30氨基酸C1INH（18-30）的短肽在体外实验中与LPS结合效果最好。为了增强C1
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作为补体系统是唯一的抑制物,C1抑制物（C1INH）的N-端氨基酸能与LPS结合,对内毒素血症以及内毒素休克具有积极的治疗意义。实验前期工作：检测了C1INH N-端1至59氨基酸片段与LPS的结合能力,然后根据其N-端1至59氨基酸序列,设计了7条短肽,经ELISA检测它们与LPS的结合能力,发现其N-端18至30氨基酸C1INH（18-30）的短肽在体外实验中与LPS结合效果最好。为了增强C1INH（18-30）与LPS的结合能力,在其两边共增加六个氨基酸,变成C1INH（14-32）。之后,为了提高C1INH（14-32）在体内的半衰期,构建了C1INH（14-32）-HSA融合蛋白。本实验在C1INH（14-32）-HSA融合蛋白成功构建之后,将此蛋白在毕赤酵母中进行表达。在此基础上,本论文研究了重组菌P.pastoris GS115/pPIH在摇瓶中的培养条件,从表达时间以及甲醇的诱导浓度分别进行梯度实验,得到最佳诱导条件为：终浓度为1%的甲醇诱导72小时,此条件下蛋白的表达量最高。此后,对C1INH（14-32）-HSA融合蛋白进行硫酸铵分级沉淀、Blue Sepharose柱亲和层析和超滤,最终得到纯度和浓度理想的C1INH（14-32）-HSA融合蛋白,即浓度为519μg/ml.将C1INH（14-32）-HSA融合蛋白按常规方法免疫家兔,制备抗C1INH（14-32）-HSA蛋白的多克隆抗体。此后用ELISAI间接法测定抗体效价,得到最佳工作稀释度为：抗原为1：200,抗体为1：1000。对此抗C1INH（14-32）-HSA进行Western blot检测抗原抗体结合能力,图谱中得到清晰的条带,表明抗C1INH（14-32）-HSA的的特异性尚佳。之后,将获得的免疫血清体经ProteinA亲和柱进行亲和层析,利用SDS-PAGE电泳鉴定所得产品的纯度。获得的抗C1INH（14-32）-HSA蛋白SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的抗C1INH（14-32）-HSA血清,重链分子量约为58kDa,轻链分子量约为27kDa。并经过免疫印迹检测其对C1INH（14-32）-HSA融合蛋白的特异性。
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