【摘 要】
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我国胃癌发病率仍然居所有癌肿的第一位,死于胃癌人数约占全球该病死亡总人数的1/4。多数患者就诊时已是晚期,手术根治率低,术前术后放化疗效果差,毒副作用大,至今没有统一的
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我国胃癌发病率仍然居所有癌肿的第一位,死于胃癌人数约占全球该病死亡总人数的1/4。多数患者就诊时已是晚期,手术根治率低,术前术后放化疗效果差,毒副作用大,至今没有统一的化疗方案,因而肿瘤的基因治疗有望成为一种新的治疗策略。细胞的失调控的异常增殖和凋亡的抑制是肿瘤发生的重要环节,细胞周期相关转录因子E2F-1能诱导细胞凋亡,具有潜在的抑癌基因的特性,但是E2F-1与胃癌的研究国内外报道很少。本研究构建了E2F-1的重组真核表达载体,利用脂质体法瞬时转染胃癌细胞株,RT-PCR及Western blot(蛋白质印迹)检测E2F-1的表达,为下一步E2F-1在胃癌中功能方面的研究打下基础。1方法:1.1 E2F-1基因真核表达载体的构建以质粒pESV-G6-E2F-1为模板,设计带EcoRⅠ/HindⅢ双酶切位点的一对引物扩增人类E2F-1的ORF(开放阅读框)全长,首先将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体中,转化筛选重组体,然后经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA中,转化筛选。1.2重组载体的鉴定取阳性重组载体扩增抽提质粒,经PCR及双酶切鉴定后,阳性重组载体命名为pCMV-E2F-1-HA,并经测序分析证实。1.3瞬时转染胃癌细胞并鉴定E2F-1的表达利用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染SGC-7901胃癌细胞,分别抽提转染24h,48h后细胞的总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western blot检测E2F-1在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。
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