【摘 要】
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目的:探索沉默P75神经营养蛋白受体（p75 neurotrophin receptor,P75NTR）联合神经生长因子（nerve growth factor,NGF）过表达对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖活性和复合脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）构建组织工程骨异位成骨能力的影响,对NGF、P
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目的:探索沉默P75神经营养蛋白受体（p75 neurotrophin receptor,P75NTR）联合神经生长因子（nerve growth factor,NGF）过表达对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖活性和复合脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）构建组织工程骨异位成骨能力的影响,对NGF、P75NTR新型复合基因在组织工程研究具有重要意义,并且为治疗骨缺损提供理论依据和新思路。方法:通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代,流式细胞仪检测干细胞表面标志物。取第3代BMSCs分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因（B组）、NGF过表达基因（C组）、沉默P75NTR和NGF过表达双基因（D组）分别传染BMSCs,以未转染细胞作为对照（A组）。转染7 d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达。细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8 d细胞的活性。Westen blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况。分别将上述4组转染后BMSCs与DBM共培养制备组织工程骨,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下组织构建皮下异位成骨模型（n=6）,术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成情况,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、ALP和骨钙素（osteocalcin,OCN）表达。结果:第3代BMSCs呈长梭形或纺锤形,经细胞形态学观察及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45流式细胞仪鉴定,所培养细胞为BMSCs。转染7 d A组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70%左右。Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义（P<0.05）。随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中D组上升最明显,3～8 d细胞活性明显高于A组（P<0.05）。倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs能与DBM形成良好黏附。皮下异位成骨实验显示,术后4周和8周,D组对比其他三组,有更多的骨组织形成;ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN m RNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:沉默P75NTR联合NGF过表达双基因共转染BMSCs复合DBM构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好促进骨组织再生。
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