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目的:本实验以体外培养永生代人系膜细胞为研究对象,观察缓激肽(bradykinin, BK)对高糖诱导的细胞产生结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、纤连蛋白(fibronectin, FN)及C-Jun氨基末端激酶(C-JunNH2-terminal kinase, JNK)通路活化的影响,采用BK-B2受体阻断剂、JNK通路阻断剂探讨BK对CTGF和FN的影响与JNK通路的相关性,以阐明BK对肾纤维化的作用及其机制,为临床肾纤维化的预防、治疗提供新的思路和方法。方法:1.为了观察BK不同浓度对高糖诱导的细胞的影响,系膜细胞用不同浓度的BK(0,10,100,1000ng/ml)孵育15分钟后和高糖(30mmol/l)共同孵育48小时,用RT-PCR法检测细胞CTGFmRNA和FNmRNA的表达。2.为了观察BK作用不同时间对高糖诱导的细胞的影响,用相同浓度的BK(100ng/ml)孵育细胞15分钟后和高糖(30mmol/l)共同孵育24 h、48h、72h,用RT-PCR法检测细胞CTGFmRNA和FNmRNA的表达。3.为了观察BK对高糖诱导细胞磷酸化JNK蛋白的影响,用同浓度BK(100ng/ml)孵育细胞15分钟后和高糖(30mmol/l)共同孵育30分钟,用Western Blotting法检测JNK磷酸化蛋白的瞬间表达。4.用BK-B2受体阻断剂HOE-140(1umol/L)和JNK通路阻断剂SP-600125(10umol/l)孵育细胞15min后,加入BK(100ng/ml)孵育15 min,再加入高糖(30mmol/l),分别用RT-PCR法测CTGF mRNA及F N mRNA的表达和用Western Blotting法测磷酸化JNK蛋白的表达量。细胞分为正常葡萄糖浓度的对照组、高糖组、BK不同浓度加高糖组、BK-B2受体阻断剂加BK加高糖组、JNK通路阻断剂加BK加高糖组。结果:1.BK随浓度的增加对高糖诱导的细胞表达CTGFmRNA的抑制作用逐渐增强,且有统计学差异(P<0.01);而使用BK-B2受体阻断剂后,这种抑制作用减弱,与BK加高糖组比表达量增多,但仍低于高糖组,有统计学差异(P<0.05);即BK通过B2受体不能完全抑制高糖诱导细胞CTGF的表达。2.同浓度BK与高糖共同作用细胞48h、72h时,细胞CTGFmRNA的表达量均较相对应的高糖组减少,有统计学差异(P<0.01);BK加高糖组在24h、48h、72h表达量随时间增加逐渐减少,组间比有统计学差异(P<0.01);即同浓度BK在24h、48h、72h对高糖诱导细胞CTGF mRNA的表达量有抑制的作用,抑制作用呈时间依赖性。3.BK不同浓度加高糖组作用48h,组间比及与高糖组比,FNmRNA的表达量无统计学差异(P>0.05);加入BK-B2受体阻断剂后,与未加入阻断剂的BK加高糖组及高糖组比,也无统计学差异(P>0.05);即BK不同浓度在48h对高糖诱导细胞的FNmRNA的表达量无影响。4.BK加高糖组在24h、48h与相应高糖组比FNmRNA的表达量无统计学差异(P>0.05),而72h表达量减少,有统计学差异(P<0.05);BK加高糖组在72h FNmRNA表达量较24h、48h明显减少,有统计学差异(P<0.05)。72h时加入BK-B2受体阻断剂后,BK对高糖诱导的细胞表达FNmRNA的抑制作用减弱,但仍低于高糖组,有统计学差异(P<0.05)。即BK在24h、48h对高糖诱导细胞产生FN无明显抑制作用,而72h有明显抑制作用。5.高糖组JNK磷酸化蛋白表达量明显高于对照组,有统计学差异(P<0.01);BK加高糖组较高糖组减少,有统计学差异(P<0.01);加入BK-B2受体阻断剂后,BK对高糖诱导细胞表达JNK磷酸化蛋白的抑制作用减弱,有统计学差异(P<0.01);使用JNK通路阻断剂后,JNK磷酸化蛋白表达量明显减少,有统计学差异(P<0.01),即BK可抑制高糖诱导的JNK磷酸化蛋白的表达。结论:1、BK呈浓度、时间依赖性抑制高糖诱导人系膜细胞表达CTGF mRNA,其作用是通过BK-B2受体实现的。2、BK可以抑制高糖诱导人系膜细胞表达FNmRNA,其作用可能与BK作用时间有关。3、BK可以抑制高糖诱导的人系膜细胞表达JNK磷酸化蛋白。4、BK上述作用的发挥可能与JNK磷酸化蛋白水平受抑制有关。