狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的一种烈性接触性人兽共患传染病,目前尚无特效治疗药物,一旦发病几乎100%死亡。虽然目前部分国家和地区已经消除了人间狂犬病,但是每年依然有至少59000人死于该病。RABV为不分节段单股负链RNA病毒,基因组含有编码5个结构蛋白的基因,其中糖蛋白（G）是决定RABV致病性和免疫原性的主要蛋白,对其氨基酸进行修饰可致RABV的致病性及其免疫原性发生改变,为研究RABV的致病机制以及狂犬病的预防和治疗提供基础。狂犬病病毒HEP-Flury株为高度致弱的非致病性毒株,在中国和日本已被广泛用作动物免疫。华南农业大学狂犬病课题组以HEP-Flury基因为骨架,通过插入免疫增强因子IFN-α、IL6、或增加另一个拷贝G基因和G基因重排,显著增强了HEP-Flury的免疫原性。该课题组从狂犬病猪的脑组织中分离到一株高度致病的RABV毒株GD-SH-01,并且建立了GD-SH-01株的反向遗传操作系统,将GD-SH-01的G基因替换至HEP-Flury后,重组病毒的致病性发生了显著的改变。在此基础上,本研究将HEP-Flury的G基因替换至GD-SH-01株,拯救获得重组狂犬病病毒r GDSH-HEPG,结果发现肌肉注射r GDSH-HEPG并未致成鼠死亡,颅内感染也仅致16.7%成鼠死亡,表明重组毒株r GDSH-HEPG的致病性已经显著降低,进一步证实G蛋白是决定GD-SH-01株致病性的主要结构蛋白。为了探究GD-SH-01株G蛋白决定病毒致病性的关键氨基酸位点,本研究比较了多个RABV毒株G蛋白氨基酸序列,根据街毒毒株与致弱毒株氨基酸差异位点,选取G蛋白氨基酸位点G19、G96、G132、G194、G243、G255、G333和G349,以GD-SH-01毒株的G基因为骨架,参考弱毒疫苗株HEP-Flury相应位点的氨基酸进行突变,拯救获得8株点突变毒株:r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194、r GDSH-G243、r GDSH-G255、r GDSH-G333和r GDSH-G349,并对所有突变毒株的体外生物学特性、致病性及其免疫原性进行研究,找到了G蛋白中除333位点以外决定致病性的关键氨基酸位点。G蛋白是RABV唯一表面膜蛋白,在病毒增殖中发挥着重要作用,单个氨基酸的突变可改变RABV的致病性、免疫原性和增殖。本研究通过测定在NA细胞上的生长曲线,发现r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194、r GDSH-G243、r GDSH-G255和r GDSH-G333增殖能力低于亲本株GD-SH-01,而r GDSH-G349的增殖能力强于GD-SH-01。NA细胞上的扩散实验显示,r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194、r GDSH-G243和r GDSH-G255的扩散能力显著低于GD-SH-01,这可能部分解释了为什么突变株增殖能力下降。病毒结合和侵入宿主细胞是病毒复制周期的第一步,以实时荧光定量PCR对病毒结合和侵入NA细胞基因组进行检测,发现r GDSH-G194和r GDSH-G255在结合能力和侵入能力两方面均显著强于亲本株GD-SH-01,r GDSH-G243仅在结合能力方面强于GD-SH-01,而r GDSH-G349的侵入能力强于GD-SH-01,说明G194、、G243、G255和G349的突变影响了病毒的结合或者侵入宿主细胞的能力,且突变株r GDSH-G194、r GDSH-G243和r GDSH-G255增强的结合能力并没有对病毒增殖起到主导作用,而r GDSH-G349增殖可能部分因为其增强的侵入能力。进一步对病毒感染NA细胞后胞内基因组进行检测,发现r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194和r GDSH-G255的基因组水平显著低于亲本株GD-SH-01感染组,这和增殖及扩散结果一致。突变株r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194和r GDSH-G243感染NA细胞后诱导了比GD-SH-01更高水平的Ⅰ型干扰素表达,这与其在NA细胞中表达更高水平的G有关。RABV的G蛋白被证实是影响病毒诱导细胞凋亡的主要结构蛋白,通过流式细胞术对突变毒株诱导NA细胞凋亡情况进行检测,结果显示r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194、r GDSH-G243和r GDSH-G255突变株在感染NA细胞后24 h和48 h诱导的凋亡显著低于GD-SH-01,说明对G蛋白单个氨基酸突变影响了其致凋亡作用;MTT实验显示,突变株感染NA细胞后,对细胞活性的影响显著低于GD-SH-01,这与凋亡结果一致,推测可能与病毒的增殖和扩散能力降低有关。本研究检测了突变株r GDSH-G255感染NA细胞后Caspase-3和Caspase-9的活性,发现r GDSH-G255感染组的Caspase-3和Caspase-9活性显著低于GD-SH-01,说明G蛋白点突变对GD-SH-01致凋亡的影响也是通过内源性凋亡通路。所有RABV突变毒株分别肌肉注射和颅内注射成鼠,以研究其致病性。结果显示,肌肉注射后,r GDSH-G19、r GDSH-G96、r GDSH-G132、r GDSH-G194、r GDSH-G243、r GDSH-G255、r GDSH-G333和r GDSH-G349感染小鼠的存活率分别为66.7%、50.0%、83.3%、83.3%、66.7%、100%、100%和100%;颅内感染后,小鼠存活率分别为0%、0%、0%、0%、0%、100%、100%和16.7%,而GD-SH-01株以两种途径感染的小鼠存活率为0,HEP-Flury株以两种途径感染的小鼠存活率为100%,说明G19、G96、G132、G194和G243位点的突变不同程度地降低了重组病毒的致病性;G349位点的突变显著降低了病毒的致病性,肌肉感染不致死成鼠,即使颅内注射也有16.7%存活率;G255和G333突变显著地降低了病毒的致病性,其致弱程度与HEP-Flury相同。外周血中中和抗体（VNA）水平监测发现,所有突变毒株均能诱导显著高于0.5 IU/m L的VNA水平,并且能保护小鼠抵抗标准攻击强毒CVS-24的攻击,说明以GD-SH-01为骨架进行致弱的RABV具有作为弱毒疫苗的潜质。进一步通过流式细胞术检测r GDSH-G255免疫小鼠后外周免疫细胞水平,结果发现,r GDSH-G255感染后小鼠淋巴结中CD19+CD40+B细胞水平显著高于GD-SH-01;免疫组化检测滴鼻感染小鼠,发现r GDSH-G255感染组小鼠脑组织CD3+T细胞浸润显著高于GD-SH-01感染组;q PCR检测显示,r GDSH-G255滴鼻感染小鼠后,脑组织中趋化因子CCL3、INF-α、IFN-β和Ig Gκ-L chain的基因表达水平显著高于GD-SH-01感染组。因此,RABV G255位点的突变,导致了病毒的完全致弱,诱导了更强的免疫应答。突变株r GDSH-G255不仅具有很好的安全性,且能产生保护性的免疫应答,为了进一步研究r GDSH-G255的突变位点是否稳定,将其在NA细胞和鼠脑进行连续传代,测序后发现r GDSH-G255的G255位点没有发生回复性突变,且G基因其他序列没有发生突变,说明G255位点突变致弱毒株具有良好的遗传稳定性。前面发现将GD-SH-01株G蛋白255位点突变后病毒致病性极其显著降低。为了确证该位点与RABV致病性的关联,本研究进一步将HEP-Flury株G蛋白255位点突变为GD-SH-01株相应位点的氨基酸,结果发现重组病毒致病性没有显著变化,并且且突变株r HEP-G255免疫小鼠后,外周血中VNA水平与亲本株HEP-Flury无显著差异,r HEP-G255诱导产生的VNA也能保护小鼠抵抗标准攻击病毒CVS-24的攻击。初步说明这个位点的突变能致弱强毒株,但是不能增加RABV的致病性,这又是一株优秀的疫苗候选病毒。本研究进一步证实了GD-SH-01株G蛋白在RABV致病性中的作用,首次发现了影响RABV体外生物学特性的多个G蛋白氨基酸位点,且首次发现了能显著影响RABV致病性的G255和G349氨基酸位点,不仅为研究RABV致病性提供了新的参考位点,而且为研究狂犬病弱毒疫苗提供安全、稳定和有效的候选株。