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研究背景和目的脓毒症是由于感染引起的全身炎症反应综合征,急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是脓毒症最常见的严重并发症之一。脓毒症AKI是临床常见的一种危重症疾病,发病率和病死率高,预后差,目前仍缺乏有效的治疗手段,亟待找出有效的治疗策略。有研究表明,炎症反应是脓毒症AKI发生和发展中的重要机制,抗炎治疗对脓毒症AKI的治疗有重大意义。近年来,LPS/TLR4信号转导通路的研究广泛,是炎症反应研究及其防治或控制手段中的重点。自噬流是一个高度动态的过程,包括自噬泡形成、自噬体形成、自噬溶酶体融合和自噬溶酶体降解四大步骤的连续进行,更能全面代表细胞自噬的过程。近年来,自噬在肾脏疾病领域的研究越来越广泛,自噬在许多肾脏疾病的发生发展中起重要的作用,但其具体的作用机制尚未明确。本文旨在探讨自噬流在脂多糖（LPS）诱导肾小管上皮细胞（HK-2细胞）炎症反应中的作用,Toll样受体4（TLR4）是否介导其中,为临床预防和治疗脓毒症AKI提供新的方向。研究内容和方法1.脂多糖刺激HK-2细胞,检测IL-1βm RNA表达取处于对数期的HK-2细胞用于实验,以脂多糖刺激HK-2细胞,建立脂多糖诱导肾小管上皮细胞炎症模型:用不同浓度（0、50、100、200μg/m L）LPS刺激HK-2细胞后于不同时间（0、4、12、24 h）收集细胞,通过荧光定量PCR（qPCR）检测HK-2细胞IL-1β的m RNA表达情况,以确定LPS的最适浓度和时间进行后续实验。2.自噬干预和TLR4阻断,检测IL-1β、TLR4、自噬相关基因LC3和p62的m RNA表达将HK-2细胞分五组做干预实验,即阴性对照组、LPS组、雷帕霉素（RAP）联合LPS组、氯喹（CQ）联合LPS组、TLR4抑制剂（TAK242）联合LPS组。RAP、CQ、TAK242提前处理HK-2细胞2 h,分别加入100μg/m L的LPS,阴性对照组加蒸馏水。继续培养12 h后通过qPCR方法检测IL-1β、TLR4、LC3和p62的m RNA表达情况3.自噬干预和TLR4阻断,检测IL-1β、TLR4、自噬相关蛋白LC3-II和p62的蛋白质表达将HK-2细胞分五组做干预实验,即阴性对照组、LPS组、RAP联合LPS组、CQ联合LPS组、TAK242联合LPS组。RAP、CQ、TAK242提前处理HK-2细胞2 h,分别加100μg/m L的LPS,阴性对照组加蒸馏水。继续培养12 h后通过蛋白质印迹试验（Western blot,WB）方法检测IL-1β、TLR4、LC3-II和p62的蛋白质表达情况。4.自噬双标腺病毒转染HK-2细胞,检测自噬流变化先用自噬双标腺病毒转染HK-2细胞24 h,将转染后的HK-2细胞分五组做干预实验,即阴性对照组、LPS组、RAP联合LPS组、CQ联合LPS组、TAK242联合LPS组。RAP、CQ和TAK242预处理HK-2细胞2 h,分别加100μg/m L的LPS,阴性对照组加蒸馏水。继续培养12 h后在共聚焦显微镜下观察自噬溶酶体的数量变化以判断自噬流的通畅程度。研究结果1.脂多糖诱导肾小管上皮细胞表达IL-1β与阴性对照组比较,用50、100、200μg/m L的LPS刺激HK-2细胞4、12、24 h均可使HK-2细胞IL-1β的m RNA表达上调（P<0.05）,LPS浓度为100μg/m L刺激HK-2细胞l2 h表达IL-1β最显著（P<0.01）。2.自噬流和TLR4参与肾小管上皮细胞IL-1β表达的调控qPCR和WB结果:与阴性对照组比较,LPS组IL-1β的m RNA和蛋白质表达上调（均P<0.05）;与LPS组比较,RAP联合LPS组IL-1β的m RNA显著下调（P<0.01）、IL-1β蛋白质表达下调（P<0.05）,CQ联合LPS组IL-1β的m RNA和蛋白质表达上调（P<0.05）,TAK242联合LPS组IL-1β的m RNA表达显著下调（P<0.01）、IL-1β蛋白质表达下调（P<0.05）。3.自噬流参与肾小管上皮细胞TLR4表达的调控qPCR和WB结果:与阴性对照组比较,LPS可诱导TLR4的m RNA表达上调（P<0.05）和蛋白质表达显著上调（P<0.01）,与LPS组比较,RAP联合LPS组TLR4的m RNA和蛋白质表达显著下调（P<0.01）,CQ联合LPS组TLR4的m RNA和蛋白质表达显著上调（P<0.01）,TAK242联合LPS组TLR4的m RNA和蛋白质表达显著下调（P<0.01）。4.TLR4介导肾小管上皮细胞自噬流阻滞4.1 LC3和p62检测自噬流结果qPCR和WB结果:与阴性对照组比较,LPS可诱导LC3的m RNA表达上调（P<0.05）、LC3-II蛋白质表达显著上调（P<0.01）,p62的m RNA和蛋白质表达显著上调（P<0.01）;与LPS组比较,RAP联合LPS组LC3的m RNA和LC3-II的蛋白质表达上调（P0.05）、但p62蛋白质表达显著下调（P0.05）,但p62的m RNA和蛋白质表达均显著上调（均P<0.01）;TAK242联合LPS组LC3的m RNA和LC3-II的蛋白质表达上调（P0.05）、但p62蛋白质表达显著下调（P<0.01）。4.2自噬双标腺病毒检测自噬流结果与阴性对照组比较,LPS组的自噬体明显增多,自噬溶酶体很少;与LPS组比较,RAP联合LPS组的自噬溶酶体明显增多;CQ联合LPS组的自噬溶酶体基本不存在,TAK242联合LPS组的自噬溶酶体明显增多。研究结论1.自噬流负调控脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症反应。2.TLR4有可能通过自噬流阻滞介导脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症反应。