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摘要：以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，研究L-半胱氨酸和金属离子对上述3种作物多酚氧化酶（PPO）活性的影响。结果表明，L-半胱氨酸对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用明显，随着L-半胱氨酸浓度增大，酶活性降低幅度越大，作用于马铃薯、苹果的IC50（导致酶活性下降50% 的抑制剂浓度）为0.05 mmol/L，甘薯为0.10 mmol/L。0.20 mmol/L L-半胱氨酸，使马铃薯、苹果和甘薯中PPO活性抑制率在90%以上，随着时间的延长，最大抑制率变化不大。无论是马铃薯、苹果还是甘薯，Mn2 和 Fe3 对它们的PPO活性有不同程度的激活作用，而Ca2 、Na 和Cu2 对PPO活性有一定的抑制作用。抑制作用最强的是Cu2 ，3.0 mmoL/L Cu2 对马铃薯PPO活性抑制率为49.1%，对苹果PPO活性抑制率为60.8%，对甘薯PPO活性抑制率为69.7%。
关键词：马铃薯；苹果；甘薯；多酚氧化酶；L-半胱氨酸；金属离子
中图分类号： TS201.2 5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0375-03
收稿日期：2014-11-12
基金项目：河南省教育厅项目（编号：12B180002）。
作者简介：廖春丽（1980—），女，河南信阳人，硕士，讲师，从事微生物发酵研究。Tel：（0375）2089072；E-mail：liao20130427@163.com。多酚氧化酶（PPO） 是广泛存在于生物体内的含铜氧化还原酶，它包括单酚氧化酶、双酚氧化酶和漆酶[1]。它在动植物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起了关键作用[2]，更是果蔬酶促褐变过程中起重要作用的一种酶[3-4]。它能将酪氨酸羟化，产生3，4-二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，多巴醌自发集合且和细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色的物质，导致组织酶促褐变[5]，因此PPO 是引起褐变的关键酶。褐变问题一直是很多果蔬收获后保藏、加工等过程中导致质量下降，经济价值降低的一个非常重要的问题，因此研究防止褐变的PPO抑制剂是农产品加工需要解决的主要问题。L-半胱氨酸（L-半胱氨酸）作为一种高效安全的PPO抑制剂，在食品保鲜中的应用已有研究[6]。本研究以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，探讨L-半胱氨酸和金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO 活性的调控，为防止果蔬贮运加工过程中褐变提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
无花号马铃薯、红富士苹果、甘薯（市售）。
1.2方法
1.2.1PPO的分离纯化将在4 ℃冰箱中预冷的马铃薯、苹果、甘薯洗净后去皮，分别切块，称取100 g加入300 mL冷冻丙酮（-20 ℃），匀浆2 min，然后抽滤，滤饼再用冷冻丙酮提取，反复3次抽滤至无色，继续抽干至无丙酮味，即制得马铃薯丙酮干粉。制得干粉置于冰箱中于-20 ℃冷冻保存，使用时分别称取5 g干粉，以1 g ∶8 mL的比例溶于在4 ℃冰箱中预冷的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值6.8）中，搅拌10 min（整个试验操作都在冰上进行），然后用冷冻离心机（4 ℃）于15 000 r/min离心 15 min，吸取上清液，即得3种作物的PPO粗酶液[7]。粗酶液进一步用40%饱和度硫酸铵盐析（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），然后用冷冻离心机（4 ℃）于 6 000 r/min 离心20 min，弃除沉淀，向收集到的上清液中加入70%饱和度硫酸铵（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），最后在冷冻离心机（4 ℃）中，于 6 000 r/min 离心 20 min，收集沉淀，沉淀用4 ℃预冷的PBS溶解，得纯化的PPO酶液。
1.2.2PPO活性的测定参照Franceso等的方法[8-9]，作部分修改。总反应体系9.5 mL，在6 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.8）的反应体系中，加入1 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚溶液为底物，置于30 ℃恒温水浴锅中保温10 min，再加入0.5 mL纯化的PPO酶液和不同量的L-半胱氨酸，30 ℃间隔1 min在475 mn波长下测定吸光度D475 nm，测定5次，每次重复3次。以不加L-半胱氨酸为对照，各处理取4 mL样品提取液进行比色。
1.2.3PPO活性的计算本试验以邻苯二酚为底物，在PPO催化下生成有色产物。其显色物质在475 nm处有最大吸收，吸光度在单位时间内的变化和单位酶活性成正比。制作D475 nm随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算1 min 吸光度变化值ΔD475 nm，然后以1 g鲜质量果蔬样品1 min 吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U）[10] ，相关公式为：
PPO活性= ΔD475 nm×VΔt×Vs×m。
式中：ΔD475 nm为反应混合液的吸光度变化值；Δt为酶促反应时间，min；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.4金属离子对酶活性的影响为了测定金属离子对PPO的影响，按表1所示组成反应体系，按“1.2.2”节方法测定PPO活性，按“1.2.3”节方法计算PPO活性，最后按下面公式计算PPO相对活性：
PPO相对活性=测定组PPO活性-对照组PPO活性对照组PPO活性×100%。
2结果与分析
2.1L-半胱氨酸对马铃薯PPO活性的影响
L-半胱氨酸对马铃薯中PPO活性的抑制作用也非常强，随着浓度越大，酶活性降低越多（图1）：当添加 0.05 mmol/L
2.2L-半胱氨酸对苹果PPO活性的影响
从图2中看出，L-半胱氨酸对苹果中的PPO活性有明显的抑制作用，随着浓度越大，酶活性降低越多：当添加 0.10 mmol/L L-半胱氨酸，1 min时苹果中PPO活性抑制率为50%；当L-半胱氨酸添加量为0.05 mmol/L，反应2 min，苹果中PPO活性抑制率为50%；添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，苹果中PPO活性抑制率为90%～97%，而且随着时间的延长，最大抑制率变化不大。加入抑制剂之后PPO活性几乎没有增长，这说明L-半胱氨酸对PPO活性的抑制作用是属于不可逆的。 2.3L-半胱氨酸对甘薯PPO活性的影响
甘薯是一种淀粉含量较高的蔬菜，洗净去皮的甘薯在空气中30 s内表面就能变黑，所以说甘薯中PPO活性非常高。由图3可见，L-半胱氨酸对甘薯中PPO活性的抑制作用也非常强，浓度越大，酶活性降低越多：当添加0.10 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为50%；当添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为 96%～97%。随着时间的延长，最大抑制率变化不大。
2.4金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性的影响
从表2可知，无论是马铃薯、苹果还是甘薯，Mn2 和 Fe3 对它们的酶活性不仅没有抑制，反而是激活作用，且随着离子浓度的增加，激活越明显。 Ca2 、Na 和Cu2 对酶活性有一定的抑制作用，其中对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用最强的是Cu2 ，随着Cu2 浓度的增大，PPO的活性逐渐下降。在Cu2 浓度为3.0 mmoL/L时对马铃薯PPO活性抑制率达到49.1%，对苹果PPO活性抑制率达到60.8%，对甘薯PPO活性抑制率达到69.7%。
3结论与讨论
L-半胱氨酸的浓度在0.20 mmol/L以内对马铃薯、苹果、甘薯3种蔬果中的PPO活性都产生抑制作用，而且随着L-半胱氨酸浓度的升高，抑制作用也更加明显，0.20 mmol/L L-半胱氨酸对3种蔬果中的PPO，活性有最大抑制作用，分别使甘薯、苹果、马铃薯PPO的活性下降44.5%、39.1%、44.8%，也就是说L-半胱氨酸对3种蔬果的抑制作用表现为：马铃薯>甘薯>苹果。
PPO属于蛋白酶，其在发生作用时需要金属离子的参与，金属离子作为酶的辅基，是不可或缺的，能使酶行使正常的功能，所以在酶存在的环境中，人为地加入一些金属离子，势必会对PPO的活性造成影响，不同的金属离子对PPO有不同的影响。因为Cl-、SO2-4 2种阴离子在一定的浓度范围内，对PPO的活性没有影响[11]，所以向反应体系中加入1 mL不同浓度的CaCl2、NaCl、CuSO4、MnCl2、FeCl3 溶液，对PPO的影响都是由于溶液中阳离子的影响。Cu2 的浓度在3.0 mmol/L以内对3种作物都有明显的抑制作用，而且都是随着Cu2 浓度的升高，对3种蔬果中的PPO的抑制作用也越来越明显，3.0 mmol/LCu2 对马铃薯、苹果、甘薯的PPO有最大的抑制作用，分别使马铃薯、苹果、甘薯PPO活性下降49.1%、60.8%、69.7%。3种蔬果对Cu2 的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
在3.0 mmol/L的浓度以内，随着Na 和Ca2 浓度的升高，3种作物中的PPO活性都表现为逐渐下降，但下降的幅度不大。Ca2 、Na 在3.0 mmol/L的浓度时，马铃薯PPO活性分别下降32.0%、36.7%，苹果PPO活性分别下降30.9%、34.3%，甘薯PPO活性分别下降27.7%、29.7%；3种作物对Ca2 和Na 的敏感程度表现为：马铃薯>苹果>甘薯。Fe3 和Mn2 在3 mmol/L的浓度以内对3种作物中的PPO有激活作用，两者的激活作用表现为：Fe3 >Mn2 ；3种作物对 Fe3 和Mn2 的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
参考文献：
[1]陈清西，宋康康. 酪氨酸酶的研究进展[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2006，45（5）：731-737.
[2]赵会全，刘望夷. 酪氨酸酶的分子生物学研究进展[J]. 国外医学：分子生物学分册，1991，13（6）：273-275，292.
[3]Sánchez-Ferrer A，Rodríguez-López J N，García-Cánovas F，et al. Tyrosinase：a comprehensive review of its mechanism[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1995，1247（1）：1-11.
[4]韩涛，李丽萍. 果蔬多酚氧化酶的抑制及褐变的防治因素[J]. 北京农学院学报，1999，14（4）：88-93.
[5]Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites[J]. Medicinal Research Reviews，1989，8（4）：525-556.
[6]Iyidogan N F，Bayindirh A. Effect of L-cysteine，kojic acid and 4-hexylresorcinol combination on inhibition of enzymatic browning in Amasya apple juice[J]. J Food Engineering，2004，62：299-304.
[7]王磊，阮征，骆成尧，等. 马铃薯多酚氧化酶酶学特性及热稳定性模型的研究[J]. 食品工业科技，2012，33（19）：92-96.
[8]Franceso P. Inhibition of apple polyphenoloxidase（PPO） by ascorbic acid，citric acid and sodium chloride[J]. Journal of Food Processing and Preservation，1993，17（1）：21-30.
[9]Kouakou T H，Kouadio Y J，Kouamé P，et al. Purification and biochemical characterization of polyphenol oxidases from embryogenic and nonembryogenic cotton（Gossypium hirsutum L.） cells[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，158（2）：285-301.
[10]黄绍华，胡晓波，王震宙，等. 山药中多酚氧化酶的活性测定及其护色研究[J]. 食品与发酵工业，2005，13（6）：27-29.
[11]薛超彬，王勤，贺量，等. 金属离子对菜青虫酚氧化酶活性的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2005，44（增刊1）：120-122.卢春霞，刘长彬，唐宗贵，等. 三合激素在奶牛乳中的降解规律[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：378-379.
关键词：马铃薯；苹果；甘薯；多酚氧化酶；L-半胱氨酸；金属离子
中图分类号： TS201.2 5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0375-03
收稿日期：2014-11-12
基金项目：河南省教育厅项目（编号：12B180002）。
作者简介：廖春丽（1980—），女，河南信阳人，硕士，讲师，从事微生物发酵研究。Tel：（0375）2089072；E-mail：liao20130427@163.com。多酚氧化酶（PPO） 是广泛存在于生物体内的含铜氧化还原酶，它包括单酚氧化酶、双酚氧化酶和漆酶[1]。它在动植物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起了关键作用[2]，更是果蔬酶促褐变过程中起重要作用的一种酶[3-4]。它能将酪氨酸羟化，产生3，4-二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，多巴醌自发集合且和细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色的物质，导致组织酶促褐变[5]，因此PPO 是引起褐变的关键酶。褐变问题一直是很多果蔬收获后保藏、加工等过程中导致质量下降，经济价值降低的一个非常重要的问题，因此研究防止褐变的PPO抑制剂是农产品加工需要解决的主要问题。L-半胱氨酸（L-半胱氨酸）作为一种高效安全的PPO抑制剂，在食品保鲜中的应用已有研究[6]。本研究以马铃薯、苹果和甘薯为研究对象，探讨L-半胱氨酸和金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO 活性的调控，为防止果蔬贮运加工过程中褐变提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
无花号马铃薯、红富士苹果、甘薯（市售）。
1.2方法
1.2.1PPO的分离纯化将在4 ℃冰箱中预冷的马铃薯、苹果、甘薯洗净后去皮，分别切块，称取100 g加入300 mL冷冻丙酮（-20 ℃），匀浆2 min，然后抽滤，滤饼再用冷冻丙酮提取，反复3次抽滤至无色，继续抽干至无丙酮味，即制得马铃薯丙酮干粉。制得干粉置于冰箱中于-20 ℃冷冻保存，使用时分别称取5 g干粉，以1 g ∶8 mL的比例溶于在4 ℃冰箱中预冷的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值6.8）中，搅拌10 min（整个试验操作都在冰上进行），然后用冷冻离心机（4 ℃）于15 000 r/min离心 15 min，吸取上清液，即得3种作物的PPO粗酶液[7]。粗酶液进一步用40%饱和度硫酸铵盐析（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），然后用冷冻离心机（4 ℃）于 6 000 r/min 离心20 min，弃除沉淀，向收集到的上清液中加入70%饱和度硫酸铵（缓慢加入并搅拌，直至完全溶解），最后在冷冻离心机（4 ℃）中，于 6 000 r/min 离心 20 min，收集沉淀，沉淀用4 ℃预冷的PBS溶解，得纯化的PPO酶液。
1.2.2PPO活性的测定参照Franceso等的方法[8-9]，作部分修改。总反应体系9.5 mL，在6 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH值6.8）的反应体系中，加入1 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚溶液为底物，置于30 ℃恒温水浴锅中保温10 min，再加入0.5 mL纯化的PPO酶液和不同量的L-半胱氨酸，30 ℃间隔1 min在475 mn波长下测定吸光度D475 nm，测定5次，每次重复3次。以不加L-半胱氨酸为对照，各处理取4 mL样品提取液进行比色。
1.2.3PPO活性的计算本试验以邻苯二酚为底物，在PPO催化下生成有色产物。其显色物质在475 nm处有最大吸收，吸光度在单位时间内的变化和单位酶活性成正比。制作D475 nm随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算1 min 吸光度变化值ΔD475 nm，然后以1 g鲜质量果蔬样品1 min 吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U）[10] ，相关公式为：
PPO活性= ΔD475 nm×VΔt×Vs×m。
式中：ΔD475 nm为反应混合液的吸光度变化值；Δt为酶促反应时间，min；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。
1.2.4金属离子对酶活性的影响为了测定金属离子对PPO的影响，按表1所示组成反应体系，按“1.2.2”节方法测定PPO活性，按“1.2.3”节方法计算PPO活性，最后按下面公式计算PPO相对活性：
PPO相对活性=测定组PPO活性-对照组PPO活性对照组PPO活性×100%。
2结果与分析
2.1L-半胱氨酸对马铃薯PPO活性的影响
L-半胱氨酸对马铃薯中PPO活性的抑制作用也非常强，随着浓度越大，酶活性降低越多（图1）：当添加 0.05 mmol/L
2.2L-半胱氨酸对苹果PPO活性的影响
从图2中看出，L-半胱氨酸对苹果中的PPO活性有明显的抑制作用，随着浓度越大，酶活性降低越多：当添加 0.10 mmol/L L-半胱氨酸，1 min时苹果中PPO活性抑制率为50%；当L-半胱氨酸添加量为0.05 mmol/L，反应2 min，苹果中PPO活性抑制率为50%；添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，苹果中PPO活性抑制率为90%～97%，而且随着时间的延长，最大抑制率变化不大。加入抑制剂之后PPO活性几乎没有增长，这说明L-半胱氨酸对PPO活性的抑制作用是属于不可逆的。 2.3L-半胱氨酸对甘薯PPO活性的影响
甘薯是一种淀粉含量较高的蔬菜，洗净去皮的甘薯在空气中30 s内表面就能变黑，所以说甘薯中PPO活性非常高。由图3可见，L-半胱氨酸对甘薯中PPO活性的抑制作用也非常强，浓度越大，酶活性降低越多：当添加0.10 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为50%；当添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率为 96%～97%。随着时间的延长，最大抑制率变化不大。
2.4金属离子对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性的影响
从表2可知，无论是马铃薯、苹果还是甘薯，Mn2 和 Fe3 对它们的酶活性不仅没有抑制，反而是激活作用，且随着离子浓度的增加，激活越明显。 Ca2 、Na 和Cu2 对酶活性有一定的抑制作用，其中对马铃薯、苹果和甘薯PPO活性抑制作用最强的是Cu2 ，随着Cu2 浓度的增大，PPO的活性逐渐下降。在Cu2 浓度为3.0 mmoL/L时对马铃薯PPO活性抑制率达到49.1%，对苹果PPO活性抑制率达到60.8%，对甘薯PPO活性抑制率达到69.7%。
3结论与讨论
L-半胱氨酸的浓度在0.20 mmol/L以内对马铃薯、苹果、甘薯3种蔬果中的PPO活性都产生抑制作用，而且随着L-半胱氨酸浓度的升高，抑制作用也更加明显，0.20 mmol/L L-半胱氨酸对3种蔬果中的PPO，活性有最大抑制作用，分别使甘薯、苹果、马铃薯PPO的活性下降44.5%、39.1%、44.8%，也就是说L-半胱氨酸对3种蔬果的抑制作用表现为：马铃薯>甘薯>苹果。
PPO属于蛋白酶，其在发生作用时需要金属离子的参与，金属离子作为酶的辅基，是不可或缺的，能使酶行使正常的功能，所以在酶存在的环境中，人为地加入一些金属离子，势必会对PPO的活性造成影响，不同的金属离子对PPO有不同的影响。因为Cl-、SO2-4 2种阴离子在一定的浓度范围内，对PPO的活性没有影响[11]，所以向反应体系中加入1 mL不同浓度的CaCl2、NaCl、CuSO4、MnCl2、FeCl3 溶液，对PPO的影响都是由于溶液中阳离子的影响。Cu2 的浓度在3.0 mmol/L以内对3种作物都有明显的抑制作用，而且都是随着Cu2 浓度的升高，对3种蔬果中的PPO的抑制作用也越来越明显，3.0 mmol/LCu2 对马铃薯、苹果、甘薯的PPO有最大的抑制作用，分别使马铃薯、苹果、甘薯PPO活性下降49.1%、60.8%、69.7%。3种蔬果对Cu2 的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
在3.0 mmol/L的浓度以内，随着Na 和Ca2 浓度的升高，3种作物中的PPO活性都表现为逐渐下降，但下降的幅度不大。Ca2 、Na 在3.0 mmol/L的浓度时，马铃薯PPO活性分别下降32.0%、36.7%，苹果PPO活性分别下降30.9%、34.3%，甘薯PPO活性分别下降27.7%、29.7%；3种作物对Ca2 和Na 的敏感程度表现为：马铃薯>苹果>甘薯。Fe3 和Mn2 在3 mmol/L的浓度以内对3种作物中的PPO有激活作用，两者的激活作用表现为：Fe3 >Mn2 ；3种作物对 Fe3 和Mn2 的敏感程度表现为：甘薯>苹果>马铃薯。
参考文献：
[1]陈清西，宋康康. 酪氨酸酶的研究进展[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2006，45（5）：731-737.
[2]赵会全，刘望夷. 酪氨酸酶的分子生物学研究进展[J]. 国外医学：分子生物学分册，1991，13（6）：273-275，292.
[3]Sánchez-Ferrer A，Rodríguez-López J N，García-Cánovas F，et al. Tyrosinase：a comprehensive review of its mechanism[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1995，1247（1）：1-11.
[4]韩涛，李丽萍. 果蔬多酚氧化酶的抑制及褐变的防治因素[J]. 北京农学院学报，1999，14（4）：88-93.
[5]Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites[J]. Medicinal Research Reviews，1989，8（4）：525-556.
[6]Iyidogan N F，Bayindirh A. Effect of L-cysteine，kojic acid and 4-hexylresorcinol combination on inhibition of enzymatic browning in Amasya apple juice[J]. J Food Engineering，2004，62：299-304.
[7]王磊，阮征，骆成尧，等. 马铃薯多酚氧化酶酶学特性及热稳定性模型的研究[J]. 食品工业科技，2012，33（19）：92-96.
[8]Franceso P. Inhibition of apple polyphenoloxidase（PPO） by ascorbic acid，citric acid and sodium chloride[J]. Journal of Food Processing and Preservation，1993，17（1）：21-30.
[9]Kouakou T H，Kouadio Y J，Kouamé P，et al. Purification and biochemical characterization of polyphenol oxidases from embryogenic and nonembryogenic cotton（Gossypium hirsutum L.） cells[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，158（2）：285-301.
[10]黄绍华，胡晓波，王震宙，等. 山药中多酚氧化酶的活性测定及其护色研究[J]. 食品与发酵工业，2005，13（6）：27-29.
[11]薛超彬，王勤，贺量，等. 金属离子对菜青虫酚氧化酶活性的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2005，44（增刊1）：120-122.卢春霞，刘长彬，唐宗贵，等. 三合激素在奶牛乳中的降解规律[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：378-379.