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摘要：应用ISSR分子标记技术对16个平菇栽培菌株进行遗传多样性研究。从16个ISSR引物中筛选出8个引物，扩增到78个多态性位点，其大小分布在200～3 000 bp之间。聚类分析结果表明，16个平菇菌株在遗传相似系数为0.75处可分为6个组群：第1组包括为以89为代表的5个菌株；第2组包括白平菇菌株；第3组包括以冀农11为代表的4个菌株；第4组包括558菌株；第5组包括以99为代表的3个菌株；第6组包括以夏抗8为代表的2个高温菌株。
关键词：平菇；ISSR；遗传多样性；聚类分析
中图分类号： S646.1 40.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0073-03
收稿日期：2015-04-07
基金项目：河北省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队建设专项；河北省科技支撑计划 （编号：15226404D）。
作者简介：郑素月（1969—），女，河北石家庄人，博士，教授，主要从事食用菌新品种选育与菌种生产技术方面的研究。E-mail：zhengsuyue@sina.com。平菇营养丰富，味道鲜美，具有较高的营养价值和保健功能，是人们喜爱的食用菌之一。平菇抗逆性强、适应性好、产量高、易栽培，是我国栽培规模最大、产量最高的一种食用菌。目前，生产上平菇菌种混杂、种源不清、同物异名严重，严重制约平菇产业的发展。随着科学技术的迅猛发展，许多生化和分子生物学手段已在食用菌种质资源研究中得到了广泛应用。微卫星间区分子标记技术具有多态性丰富、稳定可靠、试验重复性好等优点，在食用菌种质鉴定方面得到了广泛的应用。张金霞等利用ISSR技术对侧耳属菌株进行研究[1-2]；李辉平等利用ISSR技术研究木耳菌株的遗传多样性[3-4]；李莹等研究杏鲍菇的ISSR标记多态性[5]；秦莲花等用ISSR鉴别香菇生产用种[6-7]。本试验采用ISSR分子标记技术，对河北省冀中南地区16个平菇生产菌株进行鉴别及遗传多样性分析，可为解决平菇品种混乱、对平菇进行资源利用和品种选育奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌株及来源
供试平菇菌株共16个，分别收集于河北省冀中南地区，由笔者所在实验室保存。菌株编号、名称见表1。
1.2方法
1.2.1DNA提取PDA培养基平板上铺玻璃纸隔膜培养菌表1供试菌株丝，液氮研磨菌丝后用DNA提取试剂盒提取菌株DNA， 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定其D260 nm、D280 nm ，去离子水稀释到20 ng/μL左右， -20 ℃保存备用。
1.2.2引物筛选所用引物及扩增程序参考李辉平的研究[8]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。
1.2.3PCR反应体系25 μL反应体系：2 μL DNA模板（约50 ng），2.5 μL 10×Taq PCR buffer，0.8 μL dNTPs（各0.25 mmol/L） ，1 μL引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），18.5 μL双蒸水。
1.2.4扩增程序94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃补齐10 min； 4 ℃终止反应。
1.2.5琼脂糖凝胶电泳配制1.4%琼脂糖凝胶，缓冲液为1×TAE，PCR产物在电压100 V下电泳70 min。
2结果与分析
2.1DNA提取结果
16个菌株基因组DNA提取结果见图1。由于采用了基因组DNA提取试剂盒，与传统的DNA提取方法相比，得到的DNA比较纯净，条带清晰、杂质较少，在紫外分光光度计上测定其D260 nm、D280 nm。可以看出，D260 nm、D280 nm 值均在1.8～2.0
之间，可用于PCR扩增。
2.2引物的筛选
本试验从供试的16个ISSR引物中筛选出8个扩增效果较好的引物，可扩增出所有供试菌株的DNA条带，且条带清晰、稳定、分布合理、重复性好，而在对照中没有扩增出DNA条带。这些引物分别为P2、P3、P5、P6、P7、P8、P11、P13。
2.3ISSR扩增图谱分析
用筛选出的8个引物对16个平菇菌株进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点（图2），且分布均匀，大小在200～3 000 bp之间。以凝胶DNA片段的有无分别记为1或0，用统计软件NTSYSpc计算菌株间的遗传相似性系数，进行遗传相似性分析。由图3聚类分析结果可知，遗传相似水平在0.75 左右，16个菌株分为6个组群：第1组（Ⅰ）包括为以89为代表的5个菌株；第2组（Ⅱ）包括白平菇菌株；第3组（Ⅲ）包括以冀农11为代表的4个菌株；第4组（Ⅳ）包括558菌株；第5组（Ⅴ）包括以99为代表3个菌株；第6组（Ⅵ）包括夏抗8为代表的2个高温菌株。
3结论与讨论
ISSR分子标记技术是1994年由Zietkiewicz等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，其技术原理是在SSR序列的3′端或5′端加锚1～4个随机的碱基为引物，对两侧具有反向排列的简单序列间的基因片段进行扩增，不仅多态性好、稳定性高，而且简单、快速、通用性好，在食用菌种质资源研究中得到了广泛的应用[9]。笔者所在课题组在前期工作中收集了冀中南地区54个不同栽培平菇菌株，并进行了拮抗与酯酶同工酶测定，将54个菌株分为12个营养不亲和群[10]。本试验在此基础上选取16个代表菌株进一步进行ISSR分析。结果表明，用筛选出的8个引物对平菇菌株DNA进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点，大小在200～3 000 bp 之间，且分布均匀。聚类分析结果表明，同一营养亲和群的平菇89和早秋615、双抗黑平和新平106、以及99、特抗黑平和平菇206菌株群内ISSR图谱完全相同，不同营养亲和群菌株ISSR图谱存在差异，进一步说明ISSR分析在食用菌菌株鉴定方面的可靠性。
参考文献：
[1]张金霞，黄晨阳，管桂萍，等. 白黄侧耳Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析[J]. 菌物学报，2007，26（1）：115-121.
[2]马志刚，吕作舟，郑和斌，等. ISSR标记在侧耳属菌株分类学中的初步应用[J]. 华中农业大学学报，2006，25（1）：55-59.
[3]李辉平，黄晨阳，陈强，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 园艺学报，2007，34（4）：935-940.
[4]戴肖东，马银鹏，张介驰，等. 黑龙江省木耳主栽品种遗传多样性分析[J]. 生物技术，2014，24（5）：86-89.
[5]李莹，李莉，刘艳玲，等. 杏鲍菇菌种遗传多态性的ISSR分析[J]. 微生物学杂志，2014，34（2）：24-28.
[6]秦莲花，宋春艳，谭琦，等. 用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种[J]. 菌物学报，2006，25（1）：94-100.
[7]贾定洪，王波，郑林用，等. 应用拮抗及ISSR方法鉴定袋料香菇菌株[J]. 西南农业学报，2013，26（2）：832-834.
[8]李辉平. 应用ISSR标记对食用菌的遗传多样性分析[D]. 北京：中国农业科学院，2007.
[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.
[10]郑素月，张庆桥.生化标记在河北省栽培平菇种质资源鉴别中的应用研究[J]. 北方园艺，2011（14）：162-164.谢菲，陈茹阳，赵惠恩. 蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：76-78.
关键词：平菇；ISSR；遗传多样性；聚类分析
中图分类号： S646.1 40.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0073-03
收稿日期：2015-04-07
基金项目：河北省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队建设专项；河北省科技支撑计划 （编号：15226404D）。
作者简介：郑素月（1969—），女，河北石家庄人，博士，教授，主要从事食用菌新品种选育与菌种生产技术方面的研究。E-mail：zhengsuyue@sina.com。平菇营养丰富，味道鲜美，具有较高的营养价值和保健功能，是人们喜爱的食用菌之一。平菇抗逆性强、适应性好、产量高、易栽培，是我国栽培规模最大、产量最高的一种食用菌。目前，生产上平菇菌种混杂、种源不清、同物异名严重，严重制约平菇产业的发展。随着科学技术的迅猛发展，许多生化和分子生物学手段已在食用菌种质资源研究中得到了广泛应用。微卫星间区分子标记技术具有多态性丰富、稳定可靠、试验重复性好等优点，在食用菌种质鉴定方面得到了广泛的应用。张金霞等利用ISSR技术对侧耳属菌株进行研究[1-2]；李辉平等利用ISSR技术研究木耳菌株的遗传多样性[3-4]；李莹等研究杏鲍菇的ISSR标记多态性[5]；秦莲花等用ISSR鉴别香菇生产用种[6-7]。本试验采用ISSR分子标记技术，对河北省冀中南地区16个平菇生产菌株进行鉴别及遗传多样性分析，可为解决平菇品种混乱、对平菇进行资源利用和品种选育奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌株及来源
供试平菇菌株共16个，分别收集于河北省冀中南地区，由笔者所在实验室保存。菌株编号、名称见表1。
1.2方法
1.2.1DNA提取PDA培养基平板上铺玻璃纸隔膜培养菌表1供试菌株丝，液氮研磨菌丝后用DNA提取试剂盒提取菌株DNA， 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计测定其D260 nm、D280 nm ，去离子水稀释到20 ng/μL左右， -20 ℃保存备用。
1.2.2引物筛选所用引物及扩增程序参考李辉平的研究[8]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。
1.2.3PCR反应体系25 μL反应体系：2 μL DNA模板（约50 ng），2.5 μL 10×Taq PCR buffer，0.8 μL dNTPs（各0.25 mmol/L） ，1 μL引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），18.5 μL双蒸水。
1.2.4扩增程序94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃补齐10 min； 4 ℃终止反应。
1.2.5琼脂糖凝胶电泳配制1.4%琼脂糖凝胶，缓冲液为1×TAE，PCR产物在电压100 V下电泳70 min。
2结果与分析
2.1DNA提取结果
16个菌株基因组DNA提取结果见图1。由于采用了基因组DNA提取试剂盒，与传统的DNA提取方法相比，得到的DNA比较纯净，条带清晰、杂质较少，在紫外分光光度计上测定其D260 nm、D280 nm。可以看出，D260 nm、D280 nm 值均在1.8～2.0
之间，可用于PCR扩增。
2.2引物的筛选
本试验从供试的16个ISSR引物中筛选出8个扩增效果较好的引物，可扩增出所有供试菌株的DNA条带，且条带清晰、稳定、分布合理、重复性好，而在对照中没有扩增出DNA条带。这些引物分别为P2、P3、P5、P6、P7、P8、P11、P13。
2.3ISSR扩增图谱分析
用筛选出的8个引物对16个平菇菌株进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点（图2），且分布均匀，大小在200～3 000 bp之间。以凝胶DNA片段的有无分别记为1或0，用统计软件NTSYSpc计算菌株间的遗传相似性系数，进行遗传相似性分析。由图3聚类分析结果可知，遗传相似水平在0.75 左右，16个菌株分为6个组群：第1组（Ⅰ）包括为以89为代表的5个菌株；第2组（Ⅱ）包括白平菇菌株；第3组（Ⅲ）包括以冀农11为代表的4个菌株；第4组（Ⅳ）包括558菌株；第5组（Ⅴ）包括以99为代表3个菌株；第6组（Ⅵ）包括夏抗8为代表的2个高温菌株。
3结论与讨论
ISSR分子标记技术是1994年由Zietkiewicz等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，其技术原理是在SSR序列的3′端或5′端加锚1～4个随机的碱基为引物，对两侧具有反向排列的简单序列间的基因片段进行扩增，不仅多态性好、稳定性高，而且简单、快速、通用性好，在食用菌种质资源研究中得到了广泛的应用[9]。笔者所在课题组在前期工作中收集了冀中南地区54个不同栽培平菇菌株，并进行了拮抗与酯酶同工酶测定，将54个菌株分为12个营养不亲和群[10]。本试验在此基础上选取16个代表菌株进一步进行ISSR分析。结果表明，用筛选出的8个引物对平菇菌株DNA进行ISSR扩增，共扩增出78个多态性位点，大小在200～3 000 bp 之间，且分布均匀。聚类分析结果表明，同一营养亲和群的平菇89和早秋615、双抗黑平和新平106、以及99、特抗黑平和平菇206菌株群内ISSR图谱完全相同，不同营养亲和群菌株ISSR图谱存在差异，进一步说明ISSR分析在食用菌菌株鉴定方面的可靠性。
参考文献：
[1]张金霞，黄晨阳，管桂萍，等. 白黄侧耳Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析[J]. 菌物学报，2007，26（1）：115-121.
[2]马志刚，吕作舟，郑和斌，等. ISSR标记在侧耳属菌株分类学中的初步应用[J]. 华中农业大学学报，2006，25（1）：55-59.
[3]李辉平，黄晨阳，陈强，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 园艺学报，2007，34（4）：935-940.
[4]戴肖东，马银鹏，张介驰，等. 黑龙江省木耳主栽品种遗传多样性分析[J]. 生物技术，2014，24（5）：86-89.
[5]李莹，李莉，刘艳玲，等. 杏鲍菇菌种遗传多态性的ISSR分析[J]. 微生物学杂志，2014，34（2）：24-28.
[6]秦莲花，宋春艳，谭琦，等. 用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种[J]. 菌物学报，2006，25（1）：94-100.
[7]贾定洪，王波，郑林用，等. 应用拮抗及ISSR方法鉴定袋料香菇菌株[J]. 西南农业学报，2013，26（2）：832-834.
[8]李辉平. 应用ISSR标记对食用菌的遗传多样性分析[D]. 北京：中国农业科学院，2007.
[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.
[10]郑素月，张庆桥.生化标记在河北省栽培平菇种质资源鉴别中的应用研究[J]. 北方园艺，2011（14）：162-164.谢菲，陈茹阳，赵惠恩. 蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：76-78.