越来越严重的土壤盐渍化或次生盐渍化,会影响农作物的正常生长和发育。据联合国教科文组织(UNESCO)和粮农组织(FAO)最新的不完全统计,在全球范围内大约9.543亿公顷盐碱面积中,我国大约占9913万公顷。大部分农作物无法在重盐渍化的农作区生长,最终严重影响了作物生产的产量、品质和效益。水稻自古以来是我国第一大粮食作物,以稻米为主食的人口大约占65%。水稻还是盐碱地生物改良的先锋作物,所以,培育耐盐水稻的意义重大。我国盐生植物资源丰富,大约有500种盐生植物,将这些盐生植物的耐盐基因通过生物技术手段转移到作物中,是提高作物耐盐性的有效途径之一。生长于西北盐盖上的一种野生耐盐芦苇(Phragmites australis Trin.),属于禾本科植物,具有极强的耐盐性。研究和利用其与耐盐相关的功能基因,可为改善禾本科作物,如水稻的耐盐性,提供重要的外源基因供体。已被广泛应用于植物遗传转化的普通双元载体,通常只能转移20 Kb以内的外源DNA片段,所以这类载体每次只能携带少数几个功能基因。而双元细菌人工染色体(BIBAC)载体则可以实现多基因或150Kb大小的大片段DNA的转移。BIBAC载体既能用于克隆大片段DNA构建文库,又可以通过农杆菌介导直接转化植株。BIBAC载体的这一双重功能,对于将那些基因组序列未知的盐生植物DNA导入作物并在今后克隆耐盐基因方面具有重要意义。大片段DNA插入BIBAC载体是构建文库的关键,而获得高质量的高分子量核DNA(HMW-DNA)是大片段DNA插入BIBAC载体的重要前提。常规的SDS法,CTAB法甚至细胞核裂解法提取的基因组DNA片段不够大,不能满足BIBAC载体构建的要求。自Zhang等(1995)提出用低熔点琼脂糖包埋细胞核的方法制备高分子量核DNA以来,该法成为制备高分子量DNA的基本方法。该法要求使用黄化幼苗作为制备HMW-DNA的材料,而我们所使用的耐盐芦苇材料采自于野外,成熟的芦苇叶片中富含多酚、多糖、单宁、脂质等不稳定的次生代谢物质,尤其是多酚类物质氧化后跟DNA发生不可逆反应形成棕色胶状复合物,以及叶绿体、线粒体等细胞器DNA的污染,都会影响HMW-DNA的质量。本研究以耐盐的野生芦苇的成熟叶片为材料,在Zhang等(1995)方法的基础上加以改进,突破了需要以黄化苗为材料的技术限制,提出了适用于野生芦苇成熟叶片的高分子量DNA的制备方法,并利用脉冲场电泳加以分离。研究结果显示,改进包埋块法在提取野生耐盐芦苇核HMW-DNA时,能够克服非黄化苗材料富含多酚多糖的不利影响,降低核HMW-DNA制备成本,提高后续实验的连接效率。同时,该提取技术也成功地应用在盐生植物木榄上,从木榄成熟叶片中提取到可以进行后续分子生物学操作的高分子量DNA。利用所获得的芦苇DNA大片段,成功地构建了耐盐芦苇大片段DNA的BIBAC载体,为构建耐盐芦苇的BIBAC文库和实现耐盐芦苇大片段DNA的遗传转化奠定了基础。