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摘 要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同时测定食品中15种真菌毒素的方法。方法：样品经50%乙腈水溶液提取后，MycoSpinTM 400净化柱净化，同位素內标稀释后，上机测定。结果：在低、中和高水平下，这15种真菌毒素的平均回收率为68.87%～109.24%，精密度在1.97%～12.88%。15种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好，线性系数均大于0.995，检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.6～8.0 μg/kg和1.8～24.0 μg/kg。对生产日期为2019—2020年的多种类粮油食品进行15种真菌毒素的检测工作，结果显示黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的阳性检出率最高。结论：该方法灵敏度高、结果准确可靠，适合于食品中多种真菌毒素的同时快速检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱法;食品;真菌毒素
真菌毒素是食物或饲料中生长的真菌产生的代谢产物，对人类和动物有害。早在11世纪就出现过真菌毒素中毒事件，麦角菌核中的生物碱是造成中毒的主要原因，因此该病被称为麦角菌病。麦角急性中毒的症状是产生幻觉和肌肉痉挛，引起四肢动脉持续收缩和坏死。食用发霉的谷物制成的面包会引发恶心、呕吐等症状。真菌毒素具有高度污染、剧毒、稳定的理化性质，在食品加工，运输以及储存过程中已存在很长时间，很难破坏。其通过受污染的食物以及饲料直接进入人体以及动物体，或通过动物产品间接进入食物链，在人类以及动物体内长期积累可导致神经毒性、致畸性、致肾毒性、致癌性、致突变性以及致细胞毒性。
根据污染的普遍度及毒性危害严重性分析，黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮及脱氧雪腐镰刀菌烯醇是真菌毒素中具有剧毒且致癌的化学物质，也是近5年国家食品安全监督抽检中重点监测的检验项目。
传统的霉菌毒素检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫法（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）等。这些方法一般只能针对一种或一类结构类似的毒素进行快速筛选、定性或定量检测[1]。薄层色谱法简捷、便利，但重现性差、精密度低;酶联免疫法特异性强、前处理简单，但假阳性率高，不能作为确证方法;气质联用法需要衍生化前处理、操作费时费力[2]。与其他真菌毒素检测方法相比，液相色谱-串联质谱法，集高效分离和多组分定性与定量检测于一体，成为近年来霉菌毒素多残留检测技术的主流方向。
本研究利用Mycospin?400前处理技术加上同位素内标技术，建立了超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同时测定花生、玉米、大豆油等粮油食品中的15种真菌毒素的分析方法，为痕量多种真菌毒素和代谢物的同时检测提供了一个方便、快速、高效、低成本、高通量、标准化的环境友好型检测技术手段。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
美国AB SCIEX 4000Q超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Agilent公司）;Milli-Q超纯水仪（德国默克密理博公司）;Pico17微量离心机（美国赛默飞世尔公司）;BP211D分析天平（德国赛多利斯公司）;MM400型混合研磨仪（德国RETSCH GmbH）。
甲醇、乙腈、乙酸、醋酸：色谱纯，德国Merck公司;15种真菌毒素：黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、伏马菌素B1（FB1）、伏马菌素B2（FB2）、伏马菌素B3（FB3）、呕吐毒素（DON）、15-乙酰基呕吐毒素（15-ACDON）、3-乙酰基呕吐毒素（3-ACDON）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）。黄曲霉毒素混标包含B1、G1，浓度为2 μg/mL和B2、G2，浓度为0.5 μg/mL;伏马毒素混标包含伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3，浓度均为50 μg/mL;呕吐毒素、镰刀菌烯酮、15-乙酰基呕吐毒素、3-乙酰基呕吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A浓度均为10 μg/mL，以及6种同位素内标U-[13C34]-伏马毒素B1（25 μg/mL）、U-[13C34]-伏马毒素B2、U-[I3C34]-伏马毒素B3浓度为10 μg/mL、U-[13C15]-呕吐毒素（25 μg/mL）、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮浓度为25 μg/mL、U-[l3C20]-赭曲霉毒素A浓度为10 μg/mL（奥地利ROMER LABS公司）;MycoSpin?400多功能净化柱（奥地利ROMER LABS公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别配制正离子标准曲线和负离子标准曲线，75 μL不同浓度混标加上75 μL同位素内标混标混合后进样，正、负离子浓度如表1、表2所示[3]。标准曲线现配现用，如未能及时使用，在-20 ℃冰箱最多保存1周。
1.2.2 样品前处理
称取试样（25±0.1）g至250 mL三角瓶中，加入100 mL50%乙腈水溶液，于摇床上（250 r/mim）振摇90 min，过滤上清液。取10 mL滤液至试管，同时加入500 μL乙酸涡旋振荡，混匀后从试管中取750 μL样液加入MycoSpin?400多功能净化柱中，盖上盖子涡旋振荡1 min，待样液的颜色变成浅蓝色，折断MycoSpin?400多功能净化柱下端封口，将柱放于离心管，以10 000 r/min离心30 s。离心后滤液存留于离心管内，从离心管中取75 μL样液分别加入75 μL正离子内标或75 μL负离子内标，涡旋振荡20 s，上机进样[3]。 1.2.3 色谱条件
色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 um，2.1 mm×100 mm;柱温：40 ℃;流速：0.3 mL/min;进样量：
5 μL;流动相A为乙腈溶液，B为0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），梯度洗脱条件如表3所示。
1.2.4 质谱条件
电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）：正离子、负离子分别扫描;离子源温度：正离子模式600 ℃，负离子模式520 ℃;气帘气：20 psi;碰撞气：中等;电喷雾电压：正离子模式：5 500 V，负离子模式：4 500 V;Gasl：55 psi，Gas2：50 psi;其他质谱条件参见表4。
2 结果与分析
2.1 前处理方法的选择
本研究采用MycoSpin?400多功能净化柱，进一步优化提取时间和提取溶剂等条件。采用MycoSpin?400净化柱能满足对所有真菌毒素回收率均能达到70%～130%。
2.2 流动相的选择
运用相同的洗脱程序，选择3种不同的流动相对15种化合物进行分析。结果显示流动相A设置：乙腈;流动相B设置：0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），15种真菌毒素均有较好的响应。
2.3 质谱条件的优化
本试验采用对于极性特征化合物具有良好电离作用的ESI电离源，将各真菌毒素的高浓度标准溶液采用单标进样，根据已确定的色谱条件，通过比较确定各真菌毒素的离子化模式。在选定的离子化模式基础上，不断调节毛细管电压、锥孔电压、源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔气流量等质谱参数来进一步提高各母离子的信号水平[4]。在确定各化合物母离子后，通过扫描方式获得2个以上的子离子，在丰度由大到小且避免产生相互干扰的原则下，每种真菌毒素化合物最终确定了2个监测离子对。通过15种真菌毒素的多反应监测（Multitude Reaction Mode，MRM）色谱图，质谱条件可以保证质谱峰的良好峰型和丰度。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系、检出限以及定量限
配制标准溶液，将15种真菌毒素混标和正负离子内标混合，绘制标准曲线，结果见表5。由表5可知，15种真菌毒素在各自的线性范围内均可得到良好的线性关系，相关系数（r2）均能达到0.995以上。真菌毒素的检出限用3倍信噪比来确定，而定量限则用10倍信噪比来确定，其中，信噪比为S比N的比值。
2.4.2 回收率和精密度
选择花生、玉米、小米、薏米和花生油等不同基质的样品，检查15种真菌毒素在低、中和高浓度下的回收率。结果见表6。在低、中和高水平下，这15种真菌毒素的平均回收率为68.87%～109.24%，精密度在1.97%～12.88%。
2.5 食品检测中的应用
通过文献搜索和过去3年来自国家市场监督管理总局公示的不合格样品信息，选定生产日期为2019—2020年，标识生产者地址为广西、上海、浙江、江苏、辽宁和四川等地的150批次食品样品，地区类型包括城市、农村地区、风景名胜旅游区和校园周边。采样环节包括常规采样、农产品采样和网络采样。抽样地点包括农贸市场、杂货店、超级市场和网络购物。样品种类有花生、玉米、薏米、小米、花生油、大豆油、甜面酱、番茄酱、芝麻酱、酱油。采用建立的UPLC-MS/MS的方法对150份上述类别中的10种食品进行检测，结果见表7。
由表7可知，花生油中黄曲霉毒素B1阳性检出率最高，高达32.00%，薏米的玉米赤霉烯酮阳性检出率较高，高达31.81%，而玉米的玉米赤霉烯酮阳性率也达到15.00%，这可能是由于镰刀菌属的菌株易在薏米和玉米作物中生长繁殖，且常存在多种毒素同时并存的情况，比如部分花生样品中同时含有黄曲霉毒素B1和伏马毒素B1，部分花生油同时检出黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。
3 结语
本研究基于MycoSpin?400前处理技术以及同位素内标稀释技术，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了一种粮油食品中15种真菌毒素的检测方法。1次预处理以及1次进样即可同时检测食物中多种真菌毒素。同时，运用定性以及定量离子进行验证。该方法便捷、快速、低成本、高性能、高标准、环保、灵敏度高、结果准确可靠，可同时检测痕量不同的真菌毒素和代谢产物，适用于食品中多种真菌毒素的同时检测。
参考文献
[1]王瑞国，苏晓鸥，程芳芳，等.液相色谱-串联质谱法测定饲料原料中26种霉菌毒素[J].分析化学，2015，43（2）：264-270.
[2]马帅，王蒙，韩平，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法在食品真菌毒素检测中應用的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7（8）：3020-3024.
[3]张大伟，高和杨，周旌，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测饲料原料、饲料成品中18种真菌毒素含量[J].食品安全质量检测学报，2018，9（22）：5867-5876.
[4]刘家阳，张月辉，贾宏新.凝胶渗透色谱净化-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测玉米粉中10种真菌毒素[J].中国食品卫生杂志，2016，28（6）：763-768.
关键词：超高效液相色谱-串联质谱法;食品;真菌毒素
真菌毒素是食物或饲料中生长的真菌产生的代谢产物，对人类和动物有害。早在11世纪就出现过真菌毒素中毒事件，麦角菌核中的生物碱是造成中毒的主要原因，因此该病被称为麦角菌病。麦角急性中毒的症状是产生幻觉和肌肉痉挛，引起四肢动脉持续收缩和坏死。食用发霉的谷物制成的面包会引发恶心、呕吐等症状。真菌毒素具有高度污染、剧毒、稳定的理化性质，在食品加工，运输以及储存过程中已存在很长时间，很难破坏。其通过受污染的食物以及饲料直接进入人体以及动物体，或通过动物产品间接进入食物链，在人类以及动物体内长期积累可导致神经毒性、致畸性、致肾毒性、致癌性、致突变性以及致细胞毒性。
根据污染的普遍度及毒性危害严重性分析，黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮及脱氧雪腐镰刀菌烯醇是真菌毒素中具有剧毒且致癌的化学物质，也是近5年国家食品安全监督抽检中重点监测的检验项目。
传统的霉菌毒素检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫法（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）等。这些方法一般只能针对一种或一类结构类似的毒素进行快速筛选、定性或定量检测[1]。薄层色谱法简捷、便利，但重现性差、精密度低;酶联免疫法特异性强、前处理简单，但假阳性率高，不能作为确证方法;气质联用法需要衍生化前处理、操作费时费力[2]。与其他真菌毒素检测方法相比，液相色谱-串联质谱法，集高效分离和多组分定性与定量检测于一体，成为近年来霉菌毒素多残留检测技术的主流方向。
本研究利用Mycospin?400前处理技术加上同位素内标技术，建立了超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同时测定花生、玉米、大豆油等粮油食品中的15种真菌毒素的分析方法，为痕量多种真菌毒素和代谢物的同时检测提供了一个方便、快速、高效、低成本、高通量、标准化的环境友好型检测技术手段。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
美国AB SCIEX 4000Q超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Agilent公司）;Milli-Q超纯水仪（德国默克密理博公司）;Pico17微量离心机（美国赛默飞世尔公司）;BP211D分析天平（德国赛多利斯公司）;MM400型混合研磨仪（德国RETSCH GmbH）。
甲醇、乙腈、乙酸、醋酸：色谱纯，德国Merck公司;15种真菌毒素：黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、伏马菌素B1（FB1）、伏马菌素B2（FB2）、伏马菌素B3（FB3）、呕吐毒素（DON）、15-乙酰基呕吐毒素（15-ACDON）、3-乙酰基呕吐毒素（3-ACDON）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV）。黄曲霉毒素混标包含B1、G1，浓度为2 μg/mL和B2、G2，浓度为0.5 μg/mL;伏马毒素混标包含伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3，浓度均为50 μg/mL;呕吐毒素、镰刀菌烯酮、15-乙酰基呕吐毒素、3-乙酰基呕吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A浓度均为10 μg/mL，以及6种同位素内标U-[13C34]-伏马毒素B1（25 μg/mL）、U-[13C34]-伏马毒素B2、U-[I3C34]-伏马毒素B3浓度为10 μg/mL、U-[13C15]-呕吐毒素（25 μg/mL）、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮浓度为25 μg/mL、U-[l3C20]-赭曲霉毒素A浓度为10 μg/mL（奥地利ROMER LABS公司）;MycoSpin?400多功能净化柱（奥地利ROMER LABS公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别配制正离子标准曲线和负离子标准曲线，75 μL不同浓度混标加上75 μL同位素内标混标混合后进样，正、负离子浓度如表1、表2所示[3]。标准曲线现配现用，如未能及时使用，在-20 ℃冰箱最多保存1周。
1.2.2 样品前处理
称取试样（25±0.1）g至250 mL三角瓶中，加入100 mL50%乙腈水溶液，于摇床上（250 r/mim）振摇90 min，过滤上清液。取10 mL滤液至试管，同时加入500 μL乙酸涡旋振荡，混匀后从试管中取750 μL样液加入MycoSpin?400多功能净化柱中，盖上盖子涡旋振荡1 min，待样液的颜色变成浅蓝色，折断MycoSpin?400多功能净化柱下端封口，将柱放于离心管，以10 000 r/min离心30 s。离心后滤液存留于离心管内，从离心管中取75 μL样液分别加入75 μL正离子内标或75 μL负离子内标，涡旋振荡20 s，上机进样[3]。 1.2.3 色谱条件
色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 um，2.1 mm×100 mm;柱温：40 ℃;流速：0.3 mL/min;进样量：
5 μL;流动相A为乙腈溶液，B为0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），梯度洗脱条件如表3所示。
1.2.4 质谱条件
电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）：正离子、负离子分别扫描;离子源温度：正离子模式600 ℃，负离子模式520 ℃;气帘气：20 psi;碰撞气：中等;电喷雾电压：正离子模式：5 500 V，负离子模式：4 500 V;Gasl：55 psi，Gas2：50 psi;其他质谱条件参见表4。
2 结果与分析
2.1 前处理方法的选择
本研究采用MycoSpin?400多功能净化柱，进一步优化提取时间和提取溶剂等条件。采用MycoSpin?400净化柱能满足对所有真菌毒素回收率均能达到70%～130%。
2.2 流动相的选择
运用相同的洗脱程序，选择3种不同的流动相对15种化合物进行分析。结果显示流动相A设置：乙腈;流动相B设置：0.1%甲酸水（ESI+）/0.01%氨水溶液（ESI-），15种真菌毒素均有较好的响应。
2.3 质谱条件的优化
本试验采用对于极性特征化合物具有良好电离作用的ESI电离源，将各真菌毒素的高浓度标准溶液采用单标进样，根据已确定的色谱条件，通过比较确定各真菌毒素的离子化模式。在选定的离子化模式基础上，不断调节毛细管电压、锥孔电压、源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔气流量等质谱参数来进一步提高各母离子的信号水平[4]。在确定各化合物母离子后，通过扫描方式获得2个以上的子离子，在丰度由大到小且避免产生相互干扰的原则下，每种真菌毒素化合物最终确定了2个监测离子对。通过15种真菌毒素的多反应监测（Multitude Reaction Mode，MRM）色谱图，质谱条件可以保证质谱峰的良好峰型和丰度。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系、检出限以及定量限
配制标准溶液，将15种真菌毒素混标和正负离子内标混合，绘制标准曲线，结果见表5。由表5可知，15种真菌毒素在各自的线性范围内均可得到良好的线性关系，相关系数（r2）均能达到0.995以上。真菌毒素的检出限用3倍信噪比来确定，而定量限则用10倍信噪比来确定，其中，信噪比为S比N的比值。
2.4.2 回收率和精密度
选择花生、玉米、小米、薏米和花生油等不同基质的样品，检查15种真菌毒素在低、中和高浓度下的回收率。结果见表6。在低、中和高水平下，这15种真菌毒素的平均回收率为68.87%～109.24%，精密度在1.97%～12.88%。
2.5 食品检测中的应用
通过文献搜索和过去3年来自国家市场监督管理总局公示的不合格样品信息，选定生产日期为2019—2020年，标识生产者地址为广西、上海、浙江、江苏、辽宁和四川等地的150批次食品样品，地区类型包括城市、农村地区、风景名胜旅游区和校园周边。采样环节包括常规采样、农产品采样和网络采样。抽样地点包括农贸市场、杂货店、超级市场和网络购物。样品种类有花生、玉米、薏米、小米、花生油、大豆油、甜面酱、番茄酱、芝麻酱、酱油。采用建立的UPLC-MS/MS的方法对150份上述类别中的10种食品进行检测，结果见表7。
由表7可知，花生油中黄曲霉毒素B1阳性检出率最高，高达32.00%，薏米的玉米赤霉烯酮阳性检出率较高，高达31.81%，而玉米的玉米赤霉烯酮阳性率也达到15.00%，这可能是由于镰刀菌属的菌株易在薏米和玉米作物中生长繁殖，且常存在多种毒素同时并存的情况，比如部分花生样品中同时含有黄曲霉毒素B1和伏马毒素B1，部分花生油同时检出黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。
3 结语
本研究基于MycoSpin?400前处理技术以及同位素内标稀释技术，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了一种粮油食品中15种真菌毒素的检测方法。1次预处理以及1次进样即可同时检测食物中多种真菌毒素。同时，运用定性以及定量离子进行验证。该方法便捷、快速、低成本、高性能、高标准、环保、灵敏度高、结果准确可靠，可同时检测痕量不同的真菌毒素和代谢产物，适用于食品中多种真菌毒素的同时检测。
参考文献
[1]王瑞国，苏晓鸥，程芳芳，等.液相色谱-串联质谱法测定饲料原料中26种霉菌毒素[J].分析化学，2015，43（2）：264-270.
[2]马帅，王蒙，韩平，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法在食品真菌毒素检测中應用的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7（8）：3020-3024.
[3]张大伟，高和杨，周旌，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测饲料原料、饲料成品中18种真菌毒素含量[J].食品安全质量检测学报，2018，9（22）：5867-5876.
[4]刘家阳，张月辉，贾宏新.凝胶渗透色谱净化-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测玉米粉中10种真菌毒素[J].中国食品卫生杂志，2016，28（6）：763-768.