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摘 要：利用酶水解法和酶比色法2种方法来检测马铃薯自由淀粉的含量[1]，结果表明与传统的酶水解法相比，酶比色法利用多个函数拟合的方法能够科学的计算出标准工作曲线，更加准确、合理，并且在测量结果基本一致的前提下大大缩短了时间。
关键词：自由淀粉；酶水解法；酶比色法；吸光度；标准工作曲线
中图分类号：S532 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160532010
随着国家的马铃薯主粮化战略的发布，关于马铃薯储量产业化的问题也被重视[2]，而储量的关键在于提高其储存时间。马铃薯鲜薯最多能够储存8个月，在合适的条件下，马铃薯全粉可以储藏10a以上。马铃薯淀粉的含量又作为检测马铃薯全粉品质好坏的重要指标，目前最常用的检测淀粉含量的方法分别是酶水解法、酶比色法。本实验用上述的2个方法检测淀粉含量，根据标准工作曲线、直线回归方程的相关系数以及检测结果作为依据来评价2种测量方法的准确度。
1 材料与方法
1.1 材料
样品1：将新鲜马铃薯用烘干设备烘干7h制成全粉；样品2：将新鲜马铃薯用烘干设备烘干10h后制成全粉；样品3：以及市场购买辛普劳雪花熟粉。
1.2试剂与仪器
甲基红指示液：称取甲基红0.2g，用少量乙醇溶解后，定容至100mL。碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜及0.5g亚甲蓝，溶于水中并定容至1000mL。碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，定容至1000mL，存放于橡胶塞玻璃瓶中。淀粉酶溶液：称取淀粉酶0.5g，加100mL水溶解。淀粉葡萄糖酶缓冲液：淀粉葡萄糖苷酶2mg，0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠组成的缓冲液，其中缓冲液pH为4.6，将它们定容至66mL。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液：磷酸盐缓冲液200mL，再加入4-氨基安替比林0.0626g，再和200mL的0.022mol/L苯酚溶液混合。将400mL混合好的溶液中加入葡萄糖氧化酶8mg，过氧化物酶13.33g至酶溶解。酶水解法葡萄糖标准溶液：称取1g经过105℃干燥2h的葡萄糖，加水和5mL盐酸溶液，定容至1000mL。酶比色法葡萄糖标准溶液的制备：称取0.2g葡萄糖，用水溶解并稀释至100mL。
STARTER3100实验室pH计（奥豪斯仪器有限公司）；实验室天平（赛多利斯科学仪器）；加热磁力搅拌器（IKAC-MAG HS7）；TU-1900双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器制造有限责任公司）；HSS-1数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂）。
1.3 方法
1.3.1 酶水解法[3]
1.3.1.1 样品处理液制备
在150mL锥形瓶中放入100mL 65.5℃的水，立刻向瓶中倾入1.0g样品，迅速摇晃以免结块。在65.5℃水浴中间歇摇晃3min，再用力摇晃30s，使颗粒完全分开。立即抽滤，然后将滤液全部倒入250mL烧杯中，加入20mL淀粉酶溶液在60℃水浴中恒温1h并间歇搅拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液，应不显示蓝色，如果显示蓝色则应继续恒温直到加碘溶液不显蓝色为止。然后加热至沸，冷却后倒入250mL容量瓶中定容混匀。再抽滤，弃去约50mL初滤液，保留剩下200mL滤液，取50mL置于250mL锥形瓶中加5mL盐酸（1 1），装上冷凝管在沸水浴中回流1h。冷后加入2滴甲基红指示液，用氢氧化钠滴定至中和，溶液转入100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。
1.3.1.2 标定碱性酒石酸铜溶液
用150mL锥形瓶吸取5mL碱性酒石酸铜甲液和5mL碱性酒石酸铜乙液，加入10mL蒸馏水。调整加热温度以保证试剂能在2min内沸腾。滴加标准葡萄糖溶液，直至溶液内蓝色刚好褪去，记录消耗标准葡萄糖溶液的体积[4]。
1.3.1.3 试样溶液测定
用1.3.1.2方法，将标准葡萄糖溶液换成1.3.1.1试样溶液，记录消耗的试样溶液体积。同时量取50mL水及试样处理时相同量的淀粉酶溶液，用反滴定法做空白。
1.3.2 酶比色法
1.3.2.1 样品处理液制备
在150mL锥形瓶中放入100mL 65.5℃的水，立刻向瓶中倾入1.0g样品，迅速摇晃以免结块。在65.5℃水浴中间歇摇晃3min，再用力摇晃30s，使颗粒完全分开。立即抽滤，取4mL过滤液和1mL淀粉葡萄糖酶稀释液于10mL具塞试管中，在60℃水浴中酶解1h，取出冷却后加入5mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液，放入40℃水浴中显色20min，最后静置10min后在分光光度计上505nm波长处测定吸光度[5]。
1.3.2.2 酶空白和滤液空白的制备
酶空白：4mL蒸馏水加1mL淀粉葡萄糖酶稀释；滤液空白：4mL滤液加1mL蒸馏水。
2 计算方法与实验数据
2.1 酶水解法
X：淀粉含量；A1：标定时消耗的葡萄糖质量（mg）；A2：用反滴定法测空白实验时消耗的葡萄糖的质量（mg）；m：称取的样品质量（g）；V：滴定时测定样品消耗的质量（mg）。
2.2 酶比色法
2.2.1 标准工作曲线
拟合曲线公式：y=0.00169x 0.0008（相关系数R=0.9995）
图1 酶比色法标准工作曲线图
2.2.2 淀粉含量计算公式
自由淀粉含量（%）=（C1-C2-C3）×2.5×9/W
C1：测试样品的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug） ；C2：酶空白的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug）； C3：滤液空白的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug）；W：称取样品质量（mg）。 2.3 实验数据
3 讨论
酶水解法没有标准工作曲线可以制作，步骤繁琐，滴定的同时要求溶液持续沸腾，相对麻烦，而且为了确保数据可靠，需要每组至少6个平行滴定，由于要求甲液和乙液必须在2min内沸腾，所以滴定的成功率也特别低，完成一个样品大概4h左右，而且会大量消耗试剂，总的来说费时费力[6]。利用比色法测定出来的结果与酶水解法相比，虽然每个样品的数值有差异，但是基本的走势是一样的，标准曲线科学、精确，可以直接根据吸光度对应的工作曲线上的浓度求的含量，完成一个样品大概2h，大大的缩短了工作时间，而且数据误差都在实验所允许的范围内[7]。
2种方法的共同点：样品的预处理方法一样，都是利用自由淀粉在65.5℃能分离出来，选择在该温度分散并抽滤。与传统的酶水解法相比，酶比色法利用多个函数拟合的方法科学的计算出标准工作曲线，更加的准确合理。并且在测量结果基本一致的前提下大大缩短了时间。
参考文献
[1]陈俊芳，周裔彬，白丽，等.两种方法测定板栗直链淀粉含量的比较[J].中国粮油学报，2010，25（4）：93-95.
[2]吕耀昌，张涛.土豆颗粒全粉中自由淀粉的测定方法研究[J]. 食品科学，2000，21（10）：44-45.
[3]食品中淀粉的测定酶水解法；GB/T5009.9-2008[S].
[4] J. H. M. Hovenkamp-Hermelink，J. N. Vries，P. Adamse，E. Jacobsen，B. Witholt，W. J. Feenstra.Rapid estimation of the amylose，opectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato[J]. Potato Research .1988（2）.
[5]于鲁浩，马耀宏，杨俊慧，等.马铃薯块茎中淀粉含量的快速测定方法[J].食品科技，2012（3）：279-283.
[6] J M Herrero-Martínez， P J Schoenmakers， W T Kok；Determination of the amylose-amylopectin ratio of starches by iodine-affinity capillary electrophoresis[J].Available online 28，july，2004.
[7]刘佳佳，李子骐.硼酸—柠檬酸比色法测银杏枝叶中黄酮苷含量[J]. 食品与发酵工业，1999， 25（6）：42-44.
关键词：自由淀粉；酶水解法；酶比色法；吸光度；标准工作曲线
中图分类号：S532 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160532010
随着国家的马铃薯主粮化战略的发布，关于马铃薯储量产业化的问题也被重视[2]，而储量的关键在于提高其储存时间。马铃薯鲜薯最多能够储存8个月，在合适的条件下，马铃薯全粉可以储藏10a以上。马铃薯淀粉的含量又作为检测马铃薯全粉品质好坏的重要指标，目前最常用的检测淀粉含量的方法分别是酶水解法、酶比色法。本实验用上述的2个方法检测淀粉含量，根据标准工作曲线、直线回归方程的相关系数以及检测结果作为依据来评价2种测量方法的准确度。
1 材料与方法
1.1 材料
样品1：将新鲜马铃薯用烘干设备烘干7h制成全粉；样品2：将新鲜马铃薯用烘干设备烘干10h后制成全粉；样品3：以及市场购买辛普劳雪花熟粉。
1.2试剂与仪器
甲基红指示液：称取甲基红0.2g，用少量乙醇溶解后，定容至100mL。碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜及0.5g亚甲蓝，溶于水中并定容至1000mL。碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，定容至1000mL，存放于橡胶塞玻璃瓶中。淀粉酶溶液：称取淀粉酶0.5g，加100mL水溶解。淀粉葡萄糖酶缓冲液：淀粉葡萄糖苷酶2mg，0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠组成的缓冲液，其中缓冲液pH为4.6，将它们定容至66mL。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液：磷酸盐缓冲液200mL，再加入4-氨基安替比林0.0626g，再和200mL的0.022mol/L苯酚溶液混合。将400mL混合好的溶液中加入葡萄糖氧化酶8mg，过氧化物酶13.33g至酶溶解。酶水解法葡萄糖标准溶液：称取1g经过105℃干燥2h的葡萄糖，加水和5mL盐酸溶液，定容至1000mL。酶比色法葡萄糖标准溶液的制备：称取0.2g葡萄糖，用水溶解并稀释至100mL。
STARTER3100实验室pH计（奥豪斯仪器有限公司）；实验室天平（赛多利斯科学仪器）；加热磁力搅拌器（IKAC-MAG HS7）；TU-1900双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器制造有限责任公司）；HSS-1数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂）。
1.3 方法
1.3.1 酶水解法[3]
1.3.1.1 样品处理液制备
在150mL锥形瓶中放入100mL 65.5℃的水，立刻向瓶中倾入1.0g样品，迅速摇晃以免结块。在65.5℃水浴中间歇摇晃3min，再用力摇晃30s，使颗粒完全分开。立即抽滤，然后将滤液全部倒入250mL烧杯中，加入20mL淀粉酶溶液在60℃水浴中恒温1h并间歇搅拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液，应不显示蓝色，如果显示蓝色则应继续恒温直到加碘溶液不显蓝色为止。然后加热至沸，冷却后倒入250mL容量瓶中定容混匀。再抽滤，弃去约50mL初滤液，保留剩下200mL滤液，取50mL置于250mL锥形瓶中加5mL盐酸（1 1），装上冷凝管在沸水浴中回流1h。冷后加入2滴甲基红指示液，用氢氧化钠滴定至中和，溶液转入100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。
1.3.1.2 标定碱性酒石酸铜溶液
用150mL锥形瓶吸取5mL碱性酒石酸铜甲液和5mL碱性酒石酸铜乙液，加入10mL蒸馏水。调整加热温度以保证试剂能在2min内沸腾。滴加标准葡萄糖溶液，直至溶液内蓝色刚好褪去，记录消耗标准葡萄糖溶液的体积[4]。
1.3.1.3 试样溶液测定
用1.3.1.2方法，将标准葡萄糖溶液换成1.3.1.1试样溶液，记录消耗的试样溶液体积。同时量取50mL水及试样处理时相同量的淀粉酶溶液，用反滴定法做空白。
1.3.2 酶比色法
1.3.2.1 样品处理液制备
在150mL锥形瓶中放入100mL 65.5℃的水，立刻向瓶中倾入1.0g样品，迅速摇晃以免结块。在65.5℃水浴中间歇摇晃3min，再用力摇晃30s，使颗粒完全分开。立即抽滤，取4mL过滤液和1mL淀粉葡萄糖酶稀释液于10mL具塞试管中，在60℃水浴中酶解1h，取出冷却后加入5mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液，放入40℃水浴中显色20min，最后静置10min后在分光光度计上505nm波长处测定吸光度[5]。
1.3.2.2 酶空白和滤液空白的制备
酶空白：4mL蒸馏水加1mL淀粉葡萄糖酶稀释；滤液空白：4mL滤液加1mL蒸馏水。
2 计算方法与实验数据
2.1 酶水解法
X：淀粉含量；A1：标定时消耗的葡萄糖质量（mg）；A2：用反滴定法测空白实验时消耗的葡萄糖的质量（mg）；m：称取的样品质量（g）；V：滴定时测定样品消耗的质量（mg）。
2.2 酶比色法
2.2.1 标准工作曲线
拟合曲线公式：y=0.00169x 0.0008（相关系数R=0.9995）
图1 酶比色法标准工作曲线图
2.2.2 淀粉含量计算公式
自由淀粉含量（%）=（C1-C2-C3）×2.5×9/W
C1：测试样品的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug） ；C2：酶空白的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug）； C3：滤液空白的吸光度与标准曲线对应的葡萄糖质量（ug）；W：称取样品质量（mg）。 2.3 实验数据
3 讨论
酶水解法没有标准工作曲线可以制作，步骤繁琐，滴定的同时要求溶液持续沸腾，相对麻烦，而且为了确保数据可靠，需要每组至少6个平行滴定，由于要求甲液和乙液必须在2min内沸腾，所以滴定的成功率也特别低，完成一个样品大概4h左右，而且会大量消耗试剂，总的来说费时费力[6]。利用比色法测定出来的结果与酶水解法相比，虽然每个样品的数值有差异，但是基本的走势是一样的，标准曲线科学、精确，可以直接根据吸光度对应的工作曲线上的浓度求的含量，完成一个样品大概2h，大大的缩短了工作时间，而且数据误差都在实验所允许的范围内[7]。
2种方法的共同点：样品的预处理方法一样，都是利用自由淀粉在65.5℃能分离出来，选择在该温度分散并抽滤。与传统的酶水解法相比，酶比色法利用多个函数拟合的方法科学的计算出标准工作曲线，更加的准确合理。并且在测量结果基本一致的前提下大大缩短了时间。
参考文献
[1]陈俊芳，周裔彬，白丽，等.两种方法测定板栗直链淀粉含量的比较[J].中国粮油学报，2010，25（4）：93-95.
[2]吕耀昌，张涛.土豆颗粒全粉中自由淀粉的测定方法研究[J]. 食品科学，2000，21（10）：44-45.
[3]食品中淀粉的测定酶水解法；GB/T5009.9-2008[S].
[4] J. H. M. Hovenkamp-Hermelink，J. N. Vries，P. Adamse，E. Jacobsen，B. Witholt，W. J. Feenstra.Rapid estimation of the amylose，opectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato[J]. Potato Research .1988（2）.
[5]于鲁浩，马耀宏，杨俊慧，等.马铃薯块茎中淀粉含量的快速测定方法[J].食品科技，2012（3）：279-283.
[6] J M Herrero-Martínez， P J Schoenmakers， W T Kok；Determination of the amylose-amylopectin ratio of starches by iodine-affinity capillary electrophoresis[J].Available online 28，july，2004.
[7]刘佳佳，李子骐.硼酸—柠檬酸比色法测银杏枝叶中黄酮苷含量[J]. 食品与发酵工业，1999， 25（6）：42-44.