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针对显微立体视觉系统光路标定问题,设计并实现一种适合显微立体视觉系统的两步标定方法。首先,对单子光路进行初步的标定,获得放大倍率;然后,以光学工作距离为定值约束,求解内参数;再进行第二步标定求解外参数。对3个常用物镜倍率的体视显微镜进行了标定,获得了双光路的焦距、相对位置、倍率等参数的均值、标准差与相对误差,并用左右位移相对平移偏差验证了标定的准确性。研究的显微立体视觉系统标定方法为分析微沟道的半遮挡问题奠定了实验基础。