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摘要：通过山西五台山特殊菌株的采集分离与鉴定，得到一种具有重要研究价值的特殊菌株深凹杯伞，代号：Wtshyp2011001。利用液体发酵培养及培养基优化筛选，得到一套深凹杯伞（Wtshyp2011001）菌株培养的最佳培养基配方及工艺条件，对该菌丝进行粗多糖提取，为今后开展中试放大培养及药效学研究提供了可靠数据。
关键词：深凹杯伞（Wtshyp2011001）；采集分离；液体优化培养；特殊菌株；培养基配方 文献标识码：A
中图分类号：R378 文章编号：1009-2374（2017）06-0026-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.013
山西省菌类资源丰富，特别是五台山蘑菇种类很多，是一种营养极高的食用菌类作物。主要品种有台蘑小香蕈、银盘蘑菇、鸡腿菇、虎皮香蕈、秋露白等特殊菌种，具有很高的研究价值和经济价值，每年7月至9月是蘑菇采集的最佳季节。台蘑的特点：肉质细嫩，色泽乳白，菌体肥大，油性大，香味浓，可烹制成多种荤素名肴，是席上珍馐，五台山南台附近是主产地，出产的品质也最佳。台蘑除了有很高的营养价值之外，还有很好的医疗功效，长期食用可延年益寿，而且能产生对病毒的抗体，增加对感冒等病毒性疾病的抵抗力；还能起降低胆固醇，防止动脉硬化、肾脏病、胆结石、糖尿病、肝硬化等作用。我们通过五台山特殊菌种采集、分离与鉴定，得到一种具有重要研究价值的特殊菌株深凹杯伞，代号：Wtshyp2011001。
1 特殊菌种的采集、分离、鉴定
2011年7月，我们在山西五台山进行了特殊蕈菌的采集、分离，海拔1600～2300米的落叶松的天然混交林中。
1.1 菌种采集、分离、纯化过程
1.2 特殊菌种的分离、鉴定
我们对五台山特殊真菌进行了采集、收集、分离，共分离出8种特殊菌株。其中对采集分离到的特殊菌株（Wtshyp2011001）进行了鉴定，结果如下：
菌株（Wtshyp2011001）ITS序列为95 ITS45，blast结果与Ampulloclitocybe clavipes（棒柄瓶杯伞）相似性为99%，与Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯伞）相似性为96%，但是下载另外几条的Ampulloclitocybe clavipes ITS序列，相似性最高只有88%（见下图），所以该菌株是否为Ampulloclitocybe clavipes还不能确定，需要其他的marker来确证。核糖体大亚基序列为95 LSU，blast结果与Infundibulicybe gibba相似性为99%，与Ampulloclitocybe clavipes相似性为93%。结合ITS和LSU的结果，基本认为该种为Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯伞）。
表1主要对蔗糖3.0%，2.0%，1.0%；葡萄糖3.0%，2.0%，1.0%；牛肉膏1.5%，1.0%，0.5%；蛋白胨1.0%，0.5%，0%；磷酸盐：KH2PO40.05%，K2HPO40.05%；KH2PO40%，K2HPO40.1%；KH2PO40.05%，K2HPO4 0%；NaNO3 0.1%，0.3%，0.5%进行了考察，其他组分不变。
2.2 考察结果
用菌丝生长浓度作为对比参数。
培养条件：温度22℃～24℃，时间8～10天，摇瓶装量：100mL/250mL△瓶，摇瓶转速180r.p.m。
2.2.1 碳源、氮源考察结果：
从表2实验结果得出：选择葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%作为碳源、氮源较合理，且经济，菌丝生长快，菌丝相对浓度平均为42.4%。
2.2.2 磷酸鹽、无机盐的考察结果：
从表2实验结果得出：选择NaNO30.3%作为无机盐、K2HPO40.1%较合理，菌丝生长速度快，菌丝相对浓度平均为46.1%。从表1至表2培养基初步考察试验结果，通过考察方差分析，确定了台蘑深凹杯伞（Wtshyp2011001）最佳培养基配方以及培养工艺条件。葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蚕蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL 0.05%，FeSO4 0.001%，pH7.0。
2.3 深凹杯伞（Wtshyp2011001）液体培养温度考察
在对分离的台蘑深凹杯伞（Wtshyp2011001）进行培养基筛选的同时，对培养温度也进行了考察，分三个温度段：16℃～18℃、18℃～20℃、22℃～24℃，比较菌种生长浓度（见表3）。
表3温度考察试验得出：深凹杯伞（Wtshyp2011001）在培养温度22℃～24℃培养，菌丝长势最佳，菌丝浓度达到平均39.5%。
通过以上深凹杯伞（Wtshyp2011001）培养基配方考察试验及温度考察试验，我们得出：深凹杯伞（Wtshyp2011001）最佳培养基配方及培养条件：葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蚕蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL0.05%，FeSO4 0.001%，pH7.0。
培养条件：温度22℃～24℃，时间8～10d，摇瓶装量：100mL/250mL△瓶，摇瓶转速180r.p.m。
台蘑的生长与五台山特殊的地理区域、气候、植被以及牲畜活动密切相关。台蘑粗蛋白含量高达41.84%，组成台蘑蛋白质的氨基酸种类齐全，尤其是人类必需的8种氨基酸更为丰富。台蘑具有增强机体综合免疫水平、抗肿瘤、预防和辅助治疗心脑血管系统疾病以及调节内分泌、保肝护肝、镇静安神、润肺祛痰等扶正压邪的功效。
我们对采集分离的深凹杯伞（Wtshyp2011001）进行了液体优化培养，对其培养菌丝体进行了有效成分粗多糖的提取，为今后开展药效学研究奠定了良好的基础。
参考文献
[1] 王书光.五台山区台蘑资源培育开发前景探讨[J].山西林业，2015，（2）.
[2] 贺沛芳，等.五台山野生食用菌资源营养价值及展望[J].中国食用菌，2000，29（3）.
[3] 任宝生.台蘑的驯化栽培及其产业化开发[J].山西林业科技，2007，（4）.
[4] 史光中，等.五台山蘑菇（台蘑）资源及其营养价值[J].山西农业科技，1983，（6）.
[5] 王云，杨晋明，刘宏伟，孟丽君，黄静.五台山大型真菌资源调查[J].中国野生植物资源，2007，（5）.
基金项目：国家科技部国际科技合作项目“特殊蕈菌资源挖掘及评价利用的联合研发”，项目编号：2014DFR31050。
作者简介：郭素萍（1960-），女，山西康欣药业有限公司教授级高级工程师，主持国家科技部国际科技合作项目“特殊蕈菌资源挖掘及评价利用的联合研发”。
（责任编辑：黄银芳）
关键词：深凹杯伞（Wtshyp2011001）；采集分离；液体优化培养；特殊菌株；培养基配方 文献标识码：A
中图分类号：R378 文章编号：1009-2374（2017）06-0026-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.013
山西省菌类资源丰富，特别是五台山蘑菇种类很多，是一种营养极高的食用菌类作物。主要品种有台蘑小香蕈、银盘蘑菇、鸡腿菇、虎皮香蕈、秋露白等特殊菌种，具有很高的研究价值和经济价值，每年7月至9月是蘑菇采集的最佳季节。台蘑的特点：肉质细嫩，色泽乳白，菌体肥大，油性大，香味浓，可烹制成多种荤素名肴，是席上珍馐，五台山南台附近是主产地，出产的品质也最佳。台蘑除了有很高的营养价值之外，还有很好的医疗功效，长期食用可延年益寿，而且能产生对病毒的抗体，增加对感冒等病毒性疾病的抵抗力；还能起降低胆固醇，防止动脉硬化、肾脏病、胆结石、糖尿病、肝硬化等作用。我们通过五台山特殊菌种采集、分离与鉴定，得到一种具有重要研究价值的特殊菌株深凹杯伞，代号：Wtshyp2011001。
1 特殊菌种的采集、分离、鉴定
2011年7月，我们在山西五台山进行了特殊蕈菌的采集、分离，海拔1600～2300米的落叶松的天然混交林中。
1.1 菌种采集、分离、纯化过程
1.2 特殊菌种的分离、鉴定
我们对五台山特殊真菌进行了采集、收集、分离，共分离出8种特殊菌株。其中对采集分离到的特殊菌株（Wtshyp2011001）进行了鉴定，结果如下：
菌株（Wtshyp2011001）ITS序列为95 ITS45，blast结果与Ampulloclitocybe clavipes（棒柄瓶杯伞）相似性为99%，与Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯伞）相似性为96%，但是下载另外几条的Ampulloclitocybe clavipes ITS序列，相似性最高只有88%（见下图），所以该菌株是否为Ampulloclitocybe clavipes还不能确定，需要其他的marker来确证。核糖体大亚基序列为95 LSU，blast结果与Infundibulicybe gibba相似性为99%，与Ampulloclitocybe clavipes相似性为93%。结合ITS和LSU的结果，基本认为该种为Infundibulicybe gibba（Clitocybe gibba，深凹杯伞）。
表1主要对蔗糖3.0%，2.0%，1.0%；葡萄糖3.0%，2.0%，1.0%；牛肉膏1.5%，1.0%，0.5%；蛋白胨1.0%，0.5%，0%；磷酸盐：KH2PO40.05%，K2HPO40.05%；KH2PO40%，K2HPO40.1%；KH2PO40.05%，K2HPO4 0%；NaNO3 0.1%，0.3%，0.5%进行了考察，其他组分不变。
2.2 考察结果
用菌丝生长浓度作为对比参数。
培养条件：温度22℃～24℃，时间8～10天，摇瓶装量：100mL/250mL△瓶，摇瓶转速180r.p.m。
2.2.1 碳源、氮源考察结果：
从表2实验结果得出：选择葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%作为碳源、氮源较合理，且经济，菌丝生长快，菌丝相对浓度平均为42.4%。
2.2.2 磷酸鹽、无机盐的考察结果：
从表2实验结果得出：选择NaNO30.3%作为无机盐、K2HPO40.1%较合理，菌丝生长速度快，菌丝相对浓度平均为46.1%。从表1至表2培养基初步考察试验结果，通过考察方差分析，确定了台蘑深凹杯伞（Wtshyp2011001）最佳培养基配方以及培养工艺条件。葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蚕蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL 0.05%，FeSO4 0.001%，pH7.0。
2.3 深凹杯伞（Wtshyp2011001）液体培养温度考察
在对分离的台蘑深凹杯伞（Wtshyp2011001）进行培养基筛选的同时，对培养温度也进行了考察，分三个温度段：16℃～18℃、18℃～20℃、22℃～24℃，比较菌种生长浓度（见表3）。
表3温度考察试验得出：深凹杯伞（Wtshyp2011001）在培养温度22℃～24℃培养，菌丝长势最佳，菌丝浓度达到平均39.5%。
通过以上深凹杯伞（Wtshyp2011001）培养基配方考察试验及温度考察试验，我们得出：深凹杯伞（Wtshyp2011001）最佳培养基配方及培养条件：葡萄糖3.0%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，蚕蛹粉0.5%，NaNO3 0.3%，K2HPO4 0.1%，KCL0.05%，FeSO4 0.001%，pH7.0。
培养条件：温度22℃～24℃，时间8～10d，摇瓶装量：100mL/250mL△瓶，摇瓶转速180r.p.m。
台蘑的生长与五台山特殊的地理区域、气候、植被以及牲畜活动密切相关。台蘑粗蛋白含量高达41.84%，组成台蘑蛋白质的氨基酸种类齐全，尤其是人类必需的8种氨基酸更为丰富。台蘑具有增强机体综合免疫水平、抗肿瘤、预防和辅助治疗心脑血管系统疾病以及调节内分泌、保肝护肝、镇静安神、润肺祛痰等扶正压邪的功效。
我们对采集分离的深凹杯伞（Wtshyp2011001）进行了液体优化培养，对其培养菌丝体进行了有效成分粗多糖的提取，为今后开展药效学研究奠定了良好的基础。
参考文献
[1] 王书光.五台山区台蘑资源培育开发前景探讨[J].山西林业，2015，（2）.
[2] 贺沛芳，等.五台山野生食用菌资源营养价值及展望[J].中国食用菌，2000，29（3）.
[3] 任宝生.台蘑的驯化栽培及其产业化开发[J].山西林业科技，2007，（4）.
[4] 史光中，等.五台山蘑菇（台蘑）资源及其营养价值[J].山西农业科技，1983，（6）.
[5] 王云，杨晋明，刘宏伟，孟丽君，黄静.五台山大型真菌资源调查[J].中国野生植物资源，2007，（5）.
基金项目：国家科技部国际科技合作项目“特殊蕈菌资源挖掘及评价利用的联合研发”，项目编号：2014DFR31050。
作者简介：郭素萍（1960-），女，山西康欣药业有限公司教授级高级工程师，主持国家科技部国际科技合作项目“特殊蕈菌资源挖掘及评价利用的联合研发”。
（责任编辑：黄银芳）