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摘要：以核桃叶片为试材，探讨了不同培养基种类和某些培养基成分对其离体培养褐变的影响。结果表明：核桃叶片外植体在MS纸桥培养基上培养10天发生褐变率较低，1/2MS次之，MS、B5和N6培养基外植体褐变率最高。添加200～500毫克/升柠檬酸可有效减轻外植体褐变；添加2000～2500毫克/升活性炭对褐变有作用但没有柠檬酸效果好；而抗坏血酸对减轻外植体褐变无显著作用。
关键词：核桃；外植体；褐变；培养基
基金项目：甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室项目（项目号XZ1003）
中图分类号： S664.1 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.031
核桃（Juglans regia）是世界四大干果之一。目前世界核桃年产量92万吨，我国年产30万吨，占世界三分之一 [1]。核桃味甘、性温，可补肾、固精强腰、温肺定喘、破血祛瘀、润燥滑肠、补虚强体，提供营养、消炎杀菌，养护皮肤、防癌抗癌、补脑。植物组织培养技术在众多植物良种繁育上的成功应用为核桃良种的快速繁殖提供了一条有效途径[2，3]。王娟[4]等认为适当缩短转瓶周期可抑制金薄香核桃茎段外植体褐变的发生。章铁[5]等采用褐变抑制剂能明显抑制大别山山核桃不同树龄及不同部位的茎尖褐变。张小红[6]等在培养基中加入核桃硫代硫酸钠能防止褐变，并提高该种基因型核桃外植体萌芽率和新梢率。许傳俊[7]等认为不同类型培养基对外植体的分化会产生不同的影响。尚旭岚[8]等认为采用液体培养基可有效克服鹤望兰外植体褐变。梅兴国[9]认为培养基中无机盐含量越低，外植体发生褐变程度越低，培养基中无机盐浓度过高，可导致细胞褐变。
利用组织快繁技术，加速良种及其砧木无性苗的繁育，具有很高的商业价值。然而在核桃组织培养中，外植体一般在接种后就出现褐变，最后导致外植体褐变死亡，因此难以建立无性繁殖体系[10，11]。因而，在核桃离体培养中，防止外植体褐变死亡是其能否培养成功的关键。本试验以核桃叶片为研究对象，研究培养基的种类及成分对核桃叶片褐变的影响，为核桃快速繁殖和组培提供依据。
1 材料与方法
1.1供试材料
参试核桃叶片采摘于甘肃河西学院。试验于2013年9月至2014年12月在河西学院农业与生物技术学院植物组织培养室进行。
1.2外植体的灭菌
先用流水冲洗30分钟，再用75%的酒精浸泡10分钟，然后用0.1%的升汞浸泡3分钟，最后再用无菌水冲洗3～5次后，放在无菌水中备用。
1.3培养基种类对外植体褐变的影响
分别配制MS、1/2MS、MS纸桥培养基、B5和N6培养基。以MS为对照。每种培养基接种数为50个，每天观察外植体情况，记录开始发生褐变的外植体数以及褐变程度。外植体的褐变率（%）= 褐变的外植体数/总外植体数×100。
1.4抗氧化剂和吸附剂的作用
配制以下培养基：MS；MS + 200毫克/升柠檬酸；MS + 500毫克/升柠檬酸；MS + 1000毫克/升柠檬酸；MS + 5毫克/升抗坏血酸；MS + 10毫克/升抗坏血酸；MS + 20毫克/升抗坏血酸；MS + 1500毫克/升活性炭；MS + 2000毫克/升活性炭；MS + 2500毫克/升活性炭。
2 结果与分析
2.1培养基种类对核桃叶片外植体褐变的影响
表1 不同培养基对核桃叶片外植体褐变的影响
由表1可见，核桃叶片外植体用MS纸桥培养基培养的褐变率最低，培养10天尚未发生褐变，褐变率为0；在1/2MS培养基的褐变率次之，培养10天后34个发生褐变，褐变率为68%；而在MS、B5和N6培养基的外植体褐变率最高，培养10天全部发生褐变，褐变率为100%。
2.2抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响
表2 抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响
由表2可见，核桃叶片外植体在添加了抗坏血酸培养基中培养，褐变发生与对照没有明显差别，培养10天外植体基本全部褐变。培养基中添加活性炭，外植体出现黄化，培养10天也大部分褐变，但浓度为2000毫克/升或高于2000毫克/升时，可以较明显地减轻褐变的发生。与对照相比，培养基加入柠檬酸，外植体褐变减轻。
3 讨论与结论
3.1培养基类型对核桃叶片外植体褐变的影响
不同类型培养基对外植体的褐变程度会产生不同的影响。本研究结果表明，核桃叶片外植体在 MS、B5和N6培养基上的褐变发生均较为严重，而在1/2MS培养基上外植体褐变较轻，可能与1/2MS无机盐浓度较低有关。这与前人的研究结果一致，有人认为过高无机盐浓度会引起某些植物外植体中酚类物质氧化[12，13]。在桑树组培中，1/2 MS培养基，降低无机盐浓度能减轻褐化现象，降低褐化率[14]。油棕用MS培养基容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，并可诱导出愈伤组织和胚状体[15]。纸桥培养基可以很好地抑制外植体的褐变，证实了尚旭岚[16]的观点，可能是由于滤纸吸附了有害的酚类物质。
3.2培养基成分变化对核桃叶片外植体褐变的影响
试验发现，MS培养基缺乏微量元素或只加倍Fe盐用量时，外植体褐变严重；若只加倍MS培养基中大量元素含量，褐变也较严重。本结果表明，培养基中的琼脂含量降低，外植体褐变严重。这与前人的研究结果一致，李树丽[17]认为在一定范围内（琼脂 5.0～6.5克/升），琼脂用量越大，培养基硬度越大，褐变越轻。这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
3.3抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响 为了防止外植体褐变，通常在培养基中添加抗氧化剂或吸附剂，诸如抗坏血酸、柠檬酸和活性炭等。张卫芳[18]认为在培养基中加入抗氧化剂可减轻褐变。本实验中，柠檬酸能较好地抑制核桃叶片外植体褐变，而活性炭和抗坏血酸都不能有效地阻止核桃外植体褐变；这与前人的研究结果不一致，抑制银杏愈伤组织褐变效果最好的抗氧化剂是抗坏血酸，其次是PVP [19]。但是活性炭在浓度为2000毫克/升或高于2000毫克/升对核桃外植体褐变也起一定的作用，但效果没有柠檬酸好。结果表明，这些抗褐变剂对不同品种效果不同，说明它们在防止外植体褐变中的作用有一定局限性。因此，在对不同的材料进行培养时要选择适宜的抗氧化剂或吸附剂。
参考文献
[1]陆斌，宁德鲁，暴江山.核桃营养药用价值与加工技术研究进展[J].中国果菜学报，2006（4）：41-43.
[2]杨海波，王娟，周鹏程，等.核桃外植体的组织培养[J].安徽农业科学报，2011（28）：17156-17157.
[3]于艳萍，侯立群，赵登超.核桃组织培养技术研究综述[J].山东林业科技，2012（5）：117-120.
[4]王娟，田建保，贺小红等.金薄香核桃组培中灭菌及防止褐变的研究[J].山西农业大学学报，2008（3）：290-292.
[5]章铁，汪莹.大别山山核桃组培中防褐变措施的研究[J].经济林研究学报，2005（1）：21-23.
[6]张小红，代侃韧，马兆平，许巧玲.核桃离体培养中外植体褐化的研究[J].陕西林业科技，2005（4）：7-9.
[7]许传俊，李玲.几种培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响[J].亚热带植物科学报，2006（1）：9-12.
[8]尚旭岚，张健，夏晗.鹤望兰组织培养的褐变因素及防止措施[J].四川农业大学学报，2003（3）：247-250.
[9]梅兴国，等.红豆杉细胞继代培养防褐变措施的研究[J].天然产物研究与开发，2001（4）：8-11.
[10] OUTGR，MOHAPATRAA，MOHANJAINS.Tissueculture
ofornamen- talpotplant：Ariticalreviewonpresentscenarioandfuturepros
pects[J].BiotechnologyAdvances，2006（6）：531-560.
[11]张俊林，刘庆忠，刘松，等.核桃茎尖培养中防止褐变的方法[J].北京农学院学报，2007（2）：17-19.
[12]赵滢，杨树华，葛红.蝴蝶兰组织培养中褐变发生及控制的研究进展[J].北方园艺，2009（11）：110-114.
[13]陈菲，李黎，宫伟.植物组织培养的防褐化探讨[J].北方园艺，2005（2）：69.
[14]曾镭，刘燕.植物组织培养中褐化问题的研究进展[J].安徽农学通报，2007（14）：49-50.
[15]缪耀梅，李开彪，叶添谋.组织培养过程中污染和褐化的防治[J].韶关学院学报，2003（6）：101-103.
[16]尚旭岚，张健，夏晗.鹤望兰组织培养的褐变因素及防止措施[J].四川农业大学学报，2003（3）：247-250.
[17]李树丽.培养基中不同因素对中华红叶杨外植体褐变的影响[J].江苏农业科学，2014（1）：44-46.
[18]张卫芳，高疆生，欧勇慧，扬鹏卫.核桃组培中抑制褐化现象初探[J].中国农学通報，2003（5）：43-46.
[19]王义强，蒋舜村，石明旺，等.不同抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变影响的研究[J].经济林究，2003（4）：21-23.
作者简介：王法章，河西学院农业与生物技术学院，本科生在读，研究方向：种子科学与工程。
通讯作者：张春梅，博士，河西学院农业与生物技术学院，教授，研究方向：组织培养。
关键词：核桃；外植体；褐变；培养基
基金项目：甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室项目（项目号XZ1003）
中图分类号： S664.1 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.031
核桃（Juglans regia）是世界四大干果之一。目前世界核桃年产量92万吨，我国年产30万吨，占世界三分之一 [1]。核桃味甘、性温，可补肾、固精强腰、温肺定喘、破血祛瘀、润燥滑肠、补虚强体，提供营养、消炎杀菌，养护皮肤、防癌抗癌、补脑。植物组织培养技术在众多植物良种繁育上的成功应用为核桃良种的快速繁殖提供了一条有效途径[2，3]。王娟[4]等认为适当缩短转瓶周期可抑制金薄香核桃茎段外植体褐变的发生。章铁[5]等采用褐变抑制剂能明显抑制大别山山核桃不同树龄及不同部位的茎尖褐变。张小红[6]等在培养基中加入核桃硫代硫酸钠能防止褐变，并提高该种基因型核桃外植体萌芽率和新梢率。许傳俊[7]等认为不同类型培养基对外植体的分化会产生不同的影响。尚旭岚[8]等认为采用液体培养基可有效克服鹤望兰外植体褐变。梅兴国[9]认为培养基中无机盐含量越低，外植体发生褐变程度越低，培养基中无机盐浓度过高，可导致细胞褐变。
利用组织快繁技术，加速良种及其砧木无性苗的繁育，具有很高的商业价值。然而在核桃组织培养中，外植体一般在接种后就出现褐变，最后导致外植体褐变死亡，因此难以建立无性繁殖体系[10，11]。因而，在核桃离体培养中，防止外植体褐变死亡是其能否培养成功的关键。本试验以核桃叶片为研究对象，研究培养基的种类及成分对核桃叶片褐变的影响，为核桃快速繁殖和组培提供依据。
1 材料与方法
1.1供试材料
参试核桃叶片采摘于甘肃河西学院。试验于2013年9月至2014年12月在河西学院农业与生物技术学院植物组织培养室进行。
1.2外植体的灭菌
先用流水冲洗30分钟，再用75%的酒精浸泡10分钟，然后用0.1%的升汞浸泡3分钟，最后再用无菌水冲洗3～5次后，放在无菌水中备用。
1.3培养基种类对外植体褐变的影响
分别配制MS、1/2MS、MS纸桥培养基、B5和N6培养基。以MS为对照。每种培养基接种数为50个，每天观察外植体情况，记录开始发生褐变的外植体数以及褐变程度。外植体的褐变率（%）= 褐变的外植体数/总外植体数×100。
1.4抗氧化剂和吸附剂的作用
配制以下培养基：MS；MS + 200毫克/升柠檬酸；MS + 500毫克/升柠檬酸；MS + 1000毫克/升柠檬酸；MS + 5毫克/升抗坏血酸；MS + 10毫克/升抗坏血酸；MS + 20毫克/升抗坏血酸；MS + 1500毫克/升活性炭；MS + 2000毫克/升活性炭；MS + 2500毫克/升活性炭。
2 结果与分析
2.1培养基种类对核桃叶片外植体褐变的影响
表1 不同培养基对核桃叶片外植体褐变的影响
由表1可见，核桃叶片外植体用MS纸桥培养基培养的褐变率最低，培养10天尚未发生褐变，褐变率为0；在1/2MS培养基的褐变率次之，培养10天后34个发生褐变，褐变率为68%；而在MS、B5和N6培养基的外植体褐变率最高，培养10天全部发生褐变，褐变率为100%。
2.2抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响
表2 抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响
由表2可见，核桃叶片外植体在添加了抗坏血酸培养基中培养，褐变发生与对照没有明显差别，培养10天外植体基本全部褐变。培养基中添加活性炭，外植体出现黄化，培养10天也大部分褐变，但浓度为2000毫克/升或高于2000毫克/升时，可以较明显地减轻褐变的发生。与对照相比，培养基加入柠檬酸，外植体褐变减轻。
3 讨论与结论
3.1培养基类型对核桃叶片外植体褐变的影响
不同类型培养基对外植体的褐变程度会产生不同的影响。本研究结果表明，核桃叶片外植体在 MS、B5和N6培养基上的褐变发生均较为严重，而在1/2MS培养基上外植体褐变较轻，可能与1/2MS无机盐浓度较低有关。这与前人的研究结果一致，有人认为过高无机盐浓度会引起某些植物外植体中酚类物质氧化[12，13]。在桑树组培中，1/2 MS培养基，降低无机盐浓度能减轻褐化现象，降低褐化率[14]。油棕用MS培养基容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，并可诱导出愈伤组织和胚状体[15]。纸桥培养基可以很好地抑制外植体的褐变，证实了尚旭岚[16]的观点，可能是由于滤纸吸附了有害的酚类物质。
3.2培养基成分变化对核桃叶片外植体褐变的影响
试验发现，MS培养基缺乏微量元素或只加倍Fe盐用量时，外植体褐变严重；若只加倍MS培养基中大量元素含量，褐变也较严重。本结果表明，培养基中的琼脂含量降低，外植体褐变严重。这与前人的研究结果一致，李树丽[17]认为在一定范围内（琼脂 5.0～6.5克/升），琼脂用量越大，培养基硬度越大，褐变越轻。这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
3.3抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响 为了防止外植体褐变，通常在培养基中添加抗氧化剂或吸附剂，诸如抗坏血酸、柠檬酸和活性炭等。张卫芳[18]认为在培养基中加入抗氧化剂可减轻褐变。本实验中，柠檬酸能较好地抑制核桃叶片外植体褐变，而活性炭和抗坏血酸都不能有效地阻止核桃外植体褐变；这与前人的研究结果不一致，抑制银杏愈伤组织褐变效果最好的抗氧化剂是抗坏血酸，其次是PVP [19]。但是活性炭在浓度为2000毫克/升或高于2000毫克/升对核桃外植体褐变也起一定的作用，但效果没有柠檬酸好。结果表明，这些抗褐变剂对不同品种效果不同，说明它们在防止外植体褐变中的作用有一定局限性。因此，在对不同的材料进行培养时要选择适宜的抗氧化剂或吸附剂。
参考文献
[1]陆斌，宁德鲁，暴江山.核桃营养药用价值与加工技术研究进展[J].中国果菜学报，2006（4）：41-43.
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[5]章铁，汪莹.大别山山核桃组培中防褐变措施的研究[J].经济林研究学报，2005（1）：21-23.
[6]张小红，代侃韧，马兆平，许巧玲.核桃离体培养中外植体褐化的研究[J].陕西林业科技，2005（4）：7-9.
[7]许传俊，李玲.几种培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响[J].亚热带植物科学报，2006（1）：9-12.
[8]尚旭岚，张健，夏晗.鹤望兰组织培养的褐变因素及防止措施[J].四川农业大学学报，2003（3）：247-250.
[9]梅兴国，等.红豆杉细胞继代培养防褐变措施的研究[J].天然产物研究与开发，2001（4）：8-11.
[10] OUTGR，MOHAPATRAA，MOHANJAINS.Tissueculture
ofornamen- talpotplant：Ariticalreviewonpresentscenarioandfuturepros
pects[J].BiotechnologyAdvances，2006（6）：531-560.
[11]张俊林，刘庆忠，刘松，等.核桃茎尖培养中防止褐变的方法[J].北京农学院学报，2007（2）：17-19.
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[17]李树丽.培养基中不同因素对中华红叶杨外植体褐变的影响[J].江苏农业科学，2014（1）：44-46.
[18]张卫芳，高疆生，欧勇慧，扬鹏卫.核桃组培中抑制褐化现象初探[J].中国农学通報，2003（5）：43-46.
[19]王义强，蒋舜村，石明旺，等.不同抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变影响的研究[J].经济林究，2003（4）：21-23.
作者简介：王法章，河西学院农业与生物技术学院，本科生在读，研究方向：种子科学与工程。
通讯作者：张春梅，博士，河西学院农业与生物技术学院，教授，研究方向：组织培养。