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【摘要】 目的：检测促血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肾细胞癌患者外周血中的表达，探讨两者的变化及其相互关系。方法：收集56例肾细胞癌患者按肿瘤分期分为实验1、2、3组，30例健康人为对照组，采用ELISA方法分别检测标本Ang-2、VEGF的水平，对以上数据进行比较。结果：四组的VEGF两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；实验3组的Ang-2高于实验1组、实验2组、对照组，对照组的Ang-2低于实验1、2、3组，差异均有统计学意义（P<0.05）。肾细胞癌患者血清VEGF和Ang-2呈正相关（r=0.732，P<0.05）。结论：Ang-2、VEGF在肾细胞癌患者外周血中呈高表达，且与临床分期关系密切，Ang-2和VEGF在肾细胞癌血管生成中可能相互影响。
【关键词】 肾细胞癌； 促血管生成素-2； 血管内皮生长因子
The Expression and Significance of Ang-2 and VEGF in Peripheral Blood of Renal Cell Carcinoma Patient/HAN Hui，WANG Yong-gang，LIU Shang-ying.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：110-112
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of angiopoietin-2 and vascular endothelial growth factor in peripheral blood of patients with renal cell carcinoma，and to explore the changes and their relationship.Method：56 renal cell carcinoma patients were selected，according to the tumor stage were divided into experimental group 1，2，3，30 healthy people were selected as the control group，specimens was detected by ELISA method Ang-2，the levels of VEGF，the above data were compared.Result：The differences between the four groups of VEGF compsred were statistically significant（P<0.05）；the Ang-2 of experimental group 3 was higher than the experimental group 1，experimental group 2，control group，the Ang-2 of the control group was lower than the experimental group 1，2，3，the differences have the statistical significance（P<0.05）.Serum VEGF and Ang-2 were positively correlated in patients with renal cell carcinoma（r=0.732，P<0.05）.Conclusion：Ang-2 and VEGF are highly expressed in peripheral blood of patients with renal cell carcinoma and are closely related to clinical stages， and Ang-2 and VEGF may interact with each other in the angiogenesis of renal cell carcinoma.
【Key words】 Renal cell carcinoma； Angiopoietin-2； Vascular endothelial growth factor
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.031
近年來泌尿系肿瘤的发病率逐年上升，其中肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统中恶性程度较高、血管丰富的实体肿瘤，其发病率和死亡率仅次于排名第一的膀胱癌[1]。有研究发现，促血管生成素-2（Angiopoietin，Ang-2）在肿瘤新生血管的调节中起着重要的作用，与肿瘤血管的形成有密切的关系[2]，抑制Ang-2可促进血管的稳定性和减少血管形成[3]。此外，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能直接作用于血管內皮细胞促进细胞增殖，能影响血管的形成和肿瘤的生长，与肿瘤的增殖、转移密切相关[4]。本研究着重探讨Ang-2、血管内皮生长因子（VEGF）在肾细胞癌的发生发展中所扮演的角色，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本 收集2016年2-10月本院符合纳入标准的肾细胞癌患者血清标本56例为实验组，纳入标准：（1）需经病理证实为肾细胞癌；（2）实验组患者在确诊前未行手术治疗、化疗、放疗及其他抗肿瘤治疗；（3）无其他系统肿瘤、严重感染及肿瘤家族史。参照2010年美国肿瘤联会委员会（AJCC）的肿瘤分期标准将实验组分为实验1组（Ⅰ期）30例、实验2组（Ⅱ期）15例、实验3组（Ⅲ、Ⅳ期）11例，并选取体检健康的血清标本30例为对照组。四组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 試剂与仪器 由武汉博士德生物工程有限公司提供Ang-2及VEGF的ELISA试剂盒。由山西医科大学第一医院病理科提供-80 ℃低温冰箱。恒温温育箱、分光光度计、恒温振荡器、离心机、酶标仪等实验仪器由山西医科大学分子生物实验室提供。
1.3 实验方法 采集血清标本：向所有受试抽血对象说明情况并取得知情同意后，于次日凌晨空腹抽血5 mL，常规分离血清冻存于-80 ℃低温冰箱保存待用，注意避免标本反复冻融。标本采集为同一个人，待所有标本收齐后，统一进行血清Ang-2和VEGF的浓度水平的检测，实验步骤严格按照ELISA试剂盒中的说明书进行操作。取3次测定值为均值，以标准物的质量浓度为横坐标，450 nm波长吸光度值（D）为纵坐标绘制标准曲线。样品的实际质量浓度（单位pg/mL）。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行处理分析，符合正态分布的采用均数±标准差（x±s）表示。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用最小显著性差异法（LSD），相关分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
四组的VEGF两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；实验3组的Ang-2高于实验1组、实验2组、对照组，对照组的Ang-2低于实验1、2、3组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。肾细胞癌患者血清VEGF和Ang-2呈正相关（r=0.732，P<0.05）。
3 讨论
肿瘤是由肿瘤血管和肿瘤细胞两者构成的，其中肿瘤细胞对肿瘤血管的形成有促进作用，肿瘤血管的形成又可以营养肿瘤细胞，从而为肿瘤提供转移途径[5]。肿瘤血管生成过程复杂，是多种促进、抑制因子平衡后的结果，当促血管生成因子的作用强于抑制因子时，肿瘤血管便朝着生成这个方向启动[6]。
血管内皮生长因子（VEGF）为目前经典的调控血管生成物质，自2005年以来，通过抑制VEGF信号通路与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的七种新的靶向治疗药物已被批准用于治疗转移性肾细胞癌（mRCC）[7]；Ang-2作为新的调控物质被发现表达在许多肿瘤中，例如：肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等[8-11]，该物质在正常人体呈低水平表达，但在以血管渗漏和炎症增加为特点的疾病中明显增高[12-13]。关于肿瘤的VEGF基因研究较多，多项研究均观察到VEGF与肿瘤分期相关[14]。本研究显示，Ang-2和VEGF在肾细胞癌患者血清中的表达均高于健康对照，且临床分期越晚的患者血清Ang-2和VEGF的表达水平越高，这与国内外多项研究结果相似[15-17]。
此外，本研究还发现，VEGF与Ang-2存在正相关（P<0.05），这提示Ang-2与VEGF在肿瘤血管的形成过程中可能存在相互协助的关系。Ang-2通过破坏血管的外基质与內皮细胞间的作用，从而强化部分受体对VEGF的敏感性，诱导增强血管重建相关物质产生；使得血管芽生增多，这对血管新生及维持、后期增生起重要作用，在肿瘤患者中这种过程变成了恶性循环[18]。
通过阻断肿瘤血管的生成从而抗肿瘤治疗成为一个研究热点[16]，而由于肾细胞癌对化放疗均不是很敏感，且对免疫、瘤苗、基因等治疗方法的疗效还是很有限，因此以Ang-2家族作为肾细胞癌治疗的新靶点受到人们的关注[19]。临床研究表明，Ang-2的阻断剂可以阻断肿瘤生长及血管形成，特别是当结合VEGF的抗血管形成治疗时可以抑制随淋巴结转移、远处转移[20-21]。本实验受限于经费未就VEGF与Ang-2之间复杂的关系及相互作用方式展开研究，通过检测肾细胞癌血清中Ang-2和VEGF的含量希望揭示Ang-2的表达情况、影响因素以及其与经典的VEGF之间可能的相关作用，为肾细胞癌早发现、早诊断及新治疗机制提供方向。
参考文献
[1] Rini B I，Campbell S C，Escudier B.Renal cell carcinoma[J].Current Opinion in Oncology，2009，373（9669）：1119.
[2] Ward E G，Grosios K，Markham A F，et al.Genomic structures of the human angiopoietins show polymorphism in angiopoietin-2[J].Cytogenetics & Cell Genetics，2001，94（3-4）：147.
[3] Daly C，Eichten A，Castanaro C，et al.Angiopoietin-2 functions as a Tie2 agonist in tumor models， where it limits the effects of VEGF inhibition[J].Cancer Research，2013，73（1）：108-118.
[4]李光远，于德新.VEGF与肾细胞癌研究进展[J].临床泌尿外科杂志，2009，24（1）：74-78.
[5] Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis[J].Seminars in Cancer Biology，1992，3（2）：65-71.
[6] Kim D T E，Murren J R.Angiogenesis in Non-Small Cell Lung Cancer[J].American Journal of Respiratory Medicine Drugs Devices & Other Interventions，2012，1（5）：325-338. [7] Escudier B， Kataja V，Group E G W.Renal cell carcinoma：ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-up[J].Annals of Oncology，2016，21（suppl 5）：v137.
[8]何胜利，高勇，刘道永，等.Ang-1、Ang-2和Tie-2表达与肝癌血管生成的关系[J].临床肿瘤学杂志，2009，14（5）：439-442.
[9] Christian S，Annarita D L，Ilaria C，et al.Angiopoietin-2 expression in breast cancer correlates with lymph node invasion and short survival[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2003，103（4）：466-474.
[10] Tanaka F，Ishikawa S，Yanagihara K，et al.Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer[J].Cancer Research，2002，62（23）：7124-7129.
[11] Etoh T，Inoue H，Tanaka S，et al.Angiopoietin-2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma：possible in vivo regulation via induction of proteases[J].Cancer Research，2001，61（5）：2145-2153.
[12] Milam K E，Parikh S M.The angiopoietin-Tie2 signaling axis in the vascular leakage of systemic inflammation[J].Tissue Barriers，2015，3（2）：e 957 508.
[13] Conroy A L，Glover S J，Hawkes M，et al.Angiopoietin-2 levels are associated with retinopathy and predict mortality in Malawian children with cerebral malaria：a retrospective case-control study[J].Critical Care Medicine，2012，40（3）：952-959.
[14] Tomita Y.Renal cell carcinoma[J].Gan To Kagaku Ryoho，2014，41（2）：172-177.
[15] Fagiani E，Christofori G.Angiopoietins in angiogenesis[J].Cancer Letters，2013，328（1）：18-26.
[16] Gerald D，Chintharlapalli S，Augustin H G，et al.Angiopoietin-2： an attractive target for improved antiangiogenic tumor therapy[J].Cancer Research，2013，73（6）：1649-1657.
[17] Wang X，Bullock A J，Zhang L，et al.The Role of Angiopoietins as Potential Therapeutic Targets in Renal Cell Carcinoma[J].Translational Oncology，2014，7（2）：188-195.
[18] Holash J，Wiegand S J，Yancopoulos G D.New model of tumor angiogenesis：dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene，1999，18（38）：5356-5362.
[19] Tian G G，Dawson N A.New agents for the treatment of renal cell carcinoma[J].Expert Review of Anticancer Therapy，2001，1（4）：546-554.
[20] Kienast Y，Klein C，Scheuer W，et al.Ang-2-VEGF-A CrossMab，a Novel Bispecific Human IgG1 Antibody Blocking VEGF-A and Ang-2 Functions Simultaneously，Mediates Potent Antitumor，Antiangiogenic，and Antimetastatic Efficacy[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2013，19（24）：6730-6740.
[21] Holopainen T，Saharinen P，D’Amico G，et al.Effects of Angiopoietin-2-Blocking Antibody on Endothelial Cell-Cell Junctions and Lung Metastasis[J].Cancerspectrum Knowledge Environment，2012，104（6）：461-475.
（收稿日期：2017-08-10） （本文編輯：张爽）
【关键词】 肾细胞癌； 促血管生成素-2； 血管内皮生长因子
The Expression and Significance of Ang-2 and VEGF in Peripheral Blood of Renal Cell Carcinoma Patient/HAN Hui，WANG Yong-gang，LIU Shang-ying.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：110-112
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of angiopoietin-2 and vascular endothelial growth factor in peripheral blood of patients with renal cell carcinoma，and to explore the changes and their relationship.Method：56 renal cell carcinoma patients were selected，according to the tumor stage were divided into experimental group 1，2，3，30 healthy people were selected as the control group，specimens was detected by ELISA method Ang-2，the levels of VEGF，the above data were compared.Result：The differences between the four groups of VEGF compsred were statistically significant（P<0.05）；the Ang-2 of experimental group 3 was higher than the experimental group 1，experimental group 2，control group，the Ang-2 of the control group was lower than the experimental group 1，2，3，the differences have the statistical significance（P<0.05）.Serum VEGF and Ang-2 were positively correlated in patients with renal cell carcinoma（r=0.732，P<0.05）.Conclusion：Ang-2 and VEGF are highly expressed in peripheral blood of patients with renal cell carcinoma and are closely related to clinical stages， and Ang-2 and VEGF may interact with each other in the angiogenesis of renal cell carcinoma.
【Key words】 Renal cell carcinoma； Angiopoietin-2； Vascular endothelial growth factor
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.031
近年來泌尿系肿瘤的发病率逐年上升，其中肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统中恶性程度较高、血管丰富的实体肿瘤，其发病率和死亡率仅次于排名第一的膀胱癌[1]。有研究发现，促血管生成素-2（Angiopoietin，Ang-2）在肿瘤新生血管的调节中起着重要的作用，与肿瘤血管的形成有密切的关系[2]，抑制Ang-2可促进血管的稳定性和减少血管形成[3]。此外，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能直接作用于血管內皮细胞促进细胞增殖，能影响血管的形成和肿瘤的生长，与肿瘤的增殖、转移密切相关[4]。本研究着重探讨Ang-2、血管内皮生长因子（VEGF）在肾细胞癌的发生发展中所扮演的角色，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本 收集2016年2-10月本院符合纳入标准的肾细胞癌患者血清标本56例为实验组，纳入标准：（1）需经病理证实为肾细胞癌；（2）实验组患者在确诊前未行手术治疗、化疗、放疗及其他抗肿瘤治疗；（3）无其他系统肿瘤、严重感染及肿瘤家族史。参照2010年美国肿瘤联会委员会（AJCC）的肿瘤分期标准将实验组分为实验1组（Ⅰ期）30例、实验2组（Ⅱ期）15例、实验3组（Ⅲ、Ⅳ期）11例，并选取体检健康的血清标本30例为对照组。四组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 試剂与仪器 由武汉博士德生物工程有限公司提供Ang-2及VEGF的ELISA试剂盒。由山西医科大学第一医院病理科提供-80 ℃低温冰箱。恒温温育箱、分光光度计、恒温振荡器、离心机、酶标仪等实验仪器由山西医科大学分子生物实验室提供。
1.3 实验方法 采集血清标本：向所有受试抽血对象说明情况并取得知情同意后，于次日凌晨空腹抽血5 mL，常规分离血清冻存于-80 ℃低温冰箱保存待用，注意避免标本反复冻融。标本采集为同一个人，待所有标本收齐后，统一进行血清Ang-2和VEGF的浓度水平的检测，实验步骤严格按照ELISA试剂盒中的说明书进行操作。取3次测定值为均值，以标准物的质量浓度为横坐标，450 nm波长吸光度值（D）为纵坐标绘制标准曲线。样品的实际质量浓度（单位pg/mL）。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行处理分析，符合正态分布的采用均数±标准差（x±s）表示。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用最小显著性差异法（LSD），相关分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
四组的VEGF两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；实验3组的Ang-2高于实验1组、实验2组、对照组，对照组的Ang-2低于实验1、2、3组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。肾细胞癌患者血清VEGF和Ang-2呈正相关（r=0.732，P<0.05）。
3 讨论
肿瘤是由肿瘤血管和肿瘤细胞两者构成的，其中肿瘤细胞对肿瘤血管的形成有促进作用，肿瘤血管的形成又可以营养肿瘤细胞，从而为肿瘤提供转移途径[5]。肿瘤血管生成过程复杂，是多种促进、抑制因子平衡后的结果，当促血管生成因子的作用强于抑制因子时，肿瘤血管便朝着生成这个方向启动[6]。
血管内皮生长因子（VEGF）为目前经典的调控血管生成物质，自2005年以来，通过抑制VEGF信号通路与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的七种新的靶向治疗药物已被批准用于治疗转移性肾细胞癌（mRCC）[7]；Ang-2作为新的调控物质被发现表达在许多肿瘤中，例如：肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等[8-11]，该物质在正常人体呈低水平表达，但在以血管渗漏和炎症增加为特点的疾病中明显增高[12-13]。关于肿瘤的VEGF基因研究较多，多项研究均观察到VEGF与肿瘤分期相关[14]。本研究显示，Ang-2和VEGF在肾细胞癌患者血清中的表达均高于健康对照，且临床分期越晚的患者血清Ang-2和VEGF的表达水平越高，这与国内外多项研究结果相似[15-17]。
此外，本研究还发现，VEGF与Ang-2存在正相关（P<0.05），这提示Ang-2与VEGF在肿瘤血管的形成过程中可能存在相互协助的关系。Ang-2通过破坏血管的外基质与內皮细胞间的作用，从而强化部分受体对VEGF的敏感性，诱导增强血管重建相关物质产生；使得血管芽生增多，这对血管新生及维持、后期增生起重要作用，在肿瘤患者中这种过程变成了恶性循环[18]。
通过阻断肿瘤血管的生成从而抗肿瘤治疗成为一个研究热点[16]，而由于肾细胞癌对化放疗均不是很敏感，且对免疫、瘤苗、基因等治疗方法的疗效还是很有限，因此以Ang-2家族作为肾细胞癌治疗的新靶点受到人们的关注[19]。临床研究表明，Ang-2的阻断剂可以阻断肿瘤生长及血管形成，特别是当结合VEGF的抗血管形成治疗时可以抑制随淋巴结转移、远处转移[20-21]。本实验受限于经费未就VEGF与Ang-2之间复杂的关系及相互作用方式展开研究，通过检测肾细胞癌血清中Ang-2和VEGF的含量希望揭示Ang-2的表达情况、影响因素以及其与经典的VEGF之间可能的相关作用，为肾细胞癌早发现、早诊断及新治疗机制提供方向。
参考文献
[1] Rini B I，Campbell S C，Escudier B.Renal cell carcinoma[J].Current Opinion in Oncology，2009，373（9669）：1119.
[2] Ward E G，Grosios K，Markham A F，et al.Genomic structures of the human angiopoietins show polymorphism in angiopoietin-2[J].Cytogenetics & Cell Genetics，2001，94（3-4）：147.
[3] Daly C，Eichten A，Castanaro C，et al.Angiopoietin-2 functions as a Tie2 agonist in tumor models， where it limits the effects of VEGF inhibition[J].Cancer Research，2013，73（1）：108-118.
[4]李光远，于德新.VEGF与肾细胞癌研究进展[J].临床泌尿外科杂志，2009，24（1）：74-78.
[5] Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis[J].Seminars in Cancer Biology，1992，3（2）：65-71.
[6] Kim D T E，Murren J R.Angiogenesis in Non-Small Cell Lung Cancer[J].American Journal of Respiratory Medicine Drugs Devices & Other Interventions，2012，1（5）：325-338. [7] Escudier B， Kataja V，Group E G W.Renal cell carcinoma：ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-up[J].Annals of Oncology，2016，21（suppl 5）：v137.
[8]何胜利，高勇，刘道永，等.Ang-1、Ang-2和Tie-2表达与肝癌血管生成的关系[J].临床肿瘤学杂志，2009，14（5）：439-442.
[9] Christian S，Annarita D L，Ilaria C，et al.Angiopoietin-2 expression in breast cancer correlates with lymph node invasion and short survival[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2003，103（4）：466-474.
[10] Tanaka F，Ishikawa S，Yanagihara K，et al.Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer[J].Cancer Research，2002，62（23）：7124-7129.
[11] Etoh T，Inoue H，Tanaka S，et al.Angiopoietin-2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma：possible in vivo regulation via induction of proteases[J].Cancer Research，2001，61（5）：2145-2153.
[12] Milam K E，Parikh S M.The angiopoietin-Tie2 signaling axis in the vascular leakage of systemic inflammation[J].Tissue Barriers，2015，3（2）：e 957 508.
[13] Conroy A L，Glover S J，Hawkes M，et al.Angiopoietin-2 levels are associated with retinopathy and predict mortality in Malawian children with cerebral malaria：a retrospective case-control study[J].Critical Care Medicine，2012，40（3）：952-959.
[14] Tomita Y.Renal cell carcinoma[J].Gan To Kagaku Ryoho，2014，41（2）：172-177.
[15] Fagiani E，Christofori G.Angiopoietins in angiogenesis[J].Cancer Letters，2013，328（1）：18-26.
[16] Gerald D，Chintharlapalli S，Augustin H G，et al.Angiopoietin-2： an attractive target for improved antiangiogenic tumor therapy[J].Cancer Research，2013，73（6）：1649-1657.
[17] Wang X，Bullock A J，Zhang L，et al.The Role of Angiopoietins as Potential Therapeutic Targets in Renal Cell Carcinoma[J].Translational Oncology，2014，7（2）：188-195.
[18] Holash J，Wiegand S J，Yancopoulos G D.New model of tumor angiogenesis：dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene，1999，18（38）：5356-5362.
[19] Tian G G，Dawson N A.New agents for the treatment of renal cell carcinoma[J].Expert Review of Anticancer Therapy，2001，1（4）：546-554.
[20] Kienast Y，Klein C，Scheuer W，et al.Ang-2-VEGF-A CrossMab，a Novel Bispecific Human IgG1 Antibody Blocking VEGF-A and Ang-2 Functions Simultaneously，Mediates Potent Antitumor，Antiangiogenic，and Antimetastatic Efficacy[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2013，19（24）：6730-6740.
[21] Holopainen T，Saharinen P，D’Amico G，et al.Effects of Angiopoietin-2-Blocking Antibody on Endothelial Cell-Cell Junctions and Lung Metastasis[J].Cancerspectrum Knowledge Environment，2012，104（6）：461-475.
（收稿日期：2017-08-10） （本文編輯：张爽）