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摘 要：脊髓缺血再灌注损伤是在临床上常见的一种损伤，多年年来人们对脊髓缺血再灌注损伤的病因及机制进行了大量的基础研究和临床观察，但迄今仍为一大临床难题。本文通过实验，采用兔脊髓缺血再灌注损伤模型观察生酮饮食对脊髓缺血再灌注损伤时的保护作用，以期为脊髓缺血再灌注损伤防治提供实验依据。
关键词：再灌注损伤；实验；模型
生酮饮食是一个高脂、低碳水化合物和适当蛋白质的饮食。1921 年Wilder首次介绍生酮饮食并应用于临床进行治疗儿童难治性癫痫，后来用于成人药物治疗性顽固性癫痫已有数十年的历史，其有效性和安全性已得到公认。近年来有学者研究生酮饮食在不同的细胞损伤时具有保护作用。随着社会及交通的发展，高能量脊髓损伤的增加以及手术的大量开展均可能会影响脊髓供血，引起脊髓缺血再灌注损伤，严重威胁着人类的健康和生命。本文通过实验，采用兔脊髓缺血再灌注损伤模型观察生酮饮食对脊髓缺血再灌注损伤时的保护作用，以期为脊髓缺血再灌注损伤的防治提供实验依据。
1、实验材料及分组
1.1实验材料
健康兔30只（雄性），每只重量约210～240kg，由山东省实验动物中心提供。
1.2实验分组
将30只实验兔随机分为A、B、C三组（每组各10只），各组基本情况如下（表1）
表1 动物分组及处理
2、模型制作
2.1手术前准备：
实验动物称重，用脱毛剂除去腹部毛发，麻醉：用3%戊巴比妥钠1.0mL/kg注入耳缘静脉。
2.2手术操作
将兔取仰卧位固定于手术台上，并在其上方使用烤灯加热，促使直肠温度保持在38℃左右；参照Zivin法来建立脊髓缺血再灌注动物模型，具体包括以下操作步骤：第一，常规碘酒消毒，铺无菌巾；第二，取腹正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，逐层打开腹部，暴露腹主动脉，并腹主动脉向下至肾动脉，用无创伤血管夹在肾动脉起始部远端夹闭腹主动脉30min；第三，缺血时间一夹闭瞬间计时开始，30min后去掉血管夹，进行再灌注；第四，检查腹腔无明显出血及渗血，见腹主动脉及腹腔均无异常后逐层关闭腹腔，缝合腹膜及皮肤，给予尾注青霉素8万单位预防感染，并用温水纱布保护动物切口，脊髓缺血再灌注损伤模型完成后进行观察。
3、检查指标
指标检查从神经功能评价和组织病理学观察两方面检测。
3.1神经功能评价
再灌注后48h后对三组脊髓缺血再灌注损伤模型进行后肢神经功能评分。评分等级指标如下表所示（表2）：
表2 神经功能评分等级指标
3.2组织学观察
组织学检测兔再灌注48h后切除L2～4椎板，充分显露L3～4节段硬脊膜，切断周围神经根，剪开硬脊膜，将同一节段脊髓取出，置4%多聚甲醛溶液中固定。将固定组织制病理切片，HE染色，光镜下观察。
4、统计方法
采用SPSS13.5统计软件统计软件实验数据，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，等级资料采用秩和检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。
5、结果
5.1一般情况
实验兔的存活率为100%，所有实验动物无一例死于麻醉相关并发症，整个实验过程中所有动物体温均维持于正常水平，各组动物血压及心率无明显变化。
5.2神经功能评价
再灌注后48h后观察兔双后肢运动功能显示：B、C、D各组与A组（活动无异常）比较有明显差异。B组缺血30min再灌注48h后均出现不同程度的双后肢瘫痪且神经功能出现明显障碍，在神经行为学评分上与A组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）。C组与B组比较稍轻，只是部分出现后肢瘫痪的状况，在神经功能评分上比较，差异有统计学意义（P<0.05）。各组兔神经行为学评分结果见表3。
表3 神经行为学评分频数表
5.3组织病理学观察
A组再灌注48h后光镜下可见神经元胞体边缘清晰，细胞核位于中央且轮廓清晰光滑，细胞呈多极形，核仁无变化，组织无水肿与出血等异常表现。B组再灌注48h后光镜下可见神经元细胞明显肿胀，结构模糊不清晰，细胞核变浅，脊髓前角正常运动神经元细胞稀少，出现神经细胞坏死，留下死腔。细胞质出现肿胀，纤维排列不规则；C组再灌注48h后光镜下可见出现轻微的血管充血，较少出现神经元细胞固缩、形态结构改变，
6、讨论
6.1脊髓缺血再灌注损伤是指导致脊髓组织在缺血的因素去除后，脊髓组织恢复正常的血供，但脊髓神经功能不但得不到明显改善，反而在原脊髓组织缺血损伤的基础上进一步加重，因此，经处理恢复血流后损伤反而加重的现象称为脊髓缺血再灌注损伤。脊髓缺血再灌注损伤是在临床上常见的一种损伤，近20年来人们对脊髓损伤的病因及机制进行了大量的基础研究和临床观察，但迄今仍是医学上一大难题。
6.2脊髓缺血再灌注损伤究其原因是多因素引起的不可逆性损伤，是原发性脊髓损伤后的继发性损害。可能与血流恢复后脊髓组织的氧自由基过多产生、细胞凋亡加重等有关。能量代谢障碍、氧自由基与钙离子超载等因素在脊髓缺血再灌注损伤中起主要作用。脊髓缺血再灌注损伤过程中大量多聚不饱和脂肪酸存在脊髓组织中，在氧化损伤中十分敏感，氧自由基有较强的氧化性，进而引起脂质过氧化，产生神经炎症，使脊髓发生继发性损伤，导致神经细胞变性、坏死或凋亡。
6.3本实验结果显示C组神经功能障碍减轻，后肢瘫痪也有所改善。病理组织学观察C组神经元细胞损伤较正常饮食组减轻。这些说明生酮饮食对兔脊髓缺血再灌注损伤有保护作用。生酮饮食（KD）使机体能够利用脂肪代谢产生的酮体作为能量来源，可以产生抗惊厥、抗癫痫作用。它模拟了人体饥饿的状态，在糖利用受到限制时酮体成为主要能量来源。研究表明，KD具有抗神经细胞凋亡和抗氧化作用，同时KD及其代谢产物酮体对许多神经系统疾病均具有控制症状及防止疾病发展的作用。另一方面，富含脂肪酸的KD还可以明显减轻神经系统损伤后的炎症反应。实验结果表明，KD明显减轻兔脊髓缺血再灌注损伤引起的神经元损伤，为脊髓缺血再灌注损伤进一步的防治研究提供了依据。
关键词：再灌注损伤；实验；模型
生酮饮食是一个高脂、低碳水化合物和适当蛋白质的饮食。1921 年Wilder首次介绍生酮饮食并应用于临床进行治疗儿童难治性癫痫，后来用于成人药物治疗性顽固性癫痫已有数十年的历史，其有效性和安全性已得到公认。近年来有学者研究生酮饮食在不同的细胞损伤时具有保护作用。随着社会及交通的发展，高能量脊髓损伤的增加以及手术的大量开展均可能会影响脊髓供血，引起脊髓缺血再灌注损伤，严重威胁着人类的健康和生命。本文通过实验，采用兔脊髓缺血再灌注损伤模型观察生酮饮食对脊髓缺血再灌注损伤时的保护作用，以期为脊髓缺血再灌注损伤的防治提供实验依据。
1、实验材料及分组
1.1实验材料
健康兔30只（雄性），每只重量约210～240kg，由山东省实验动物中心提供。
1.2实验分组
将30只实验兔随机分为A、B、C三组（每组各10只），各组基本情况如下（表1）
表1 动物分组及处理
2、模型制作
2.1手术前准备：
实验动物称重，用脱毛剂除去腹部毛发，麻醉：用3%戊巴比妥钠1.0mL/kg注入耳缘静脉。
2.2手术操作
将兔取仰卧位固定于手术台上，并在其上方使用烤灯加热，促使直肠温度保持在38℃左右；参照Zivin法来建立脊髓缺血再灌注动物模型，具体包括以下操作步骤：第一，常规碘酒消毒，铺无菌巾；第二，取腹正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，逐层打开腹部，暴露腹主动脉，并腹主动脉向下至肾动脉，用无创伤血管夹在肾动脉起始部远端夹闭腹主动脉30min；第三，缺血时间一夹闭瞬间计时开始，30min后去掉血管夹，进行再灌注；第四，检查腹腔无明显出血及渗血，见腹主动脉及腹腔均无异常后逐层关闭腹腔，缝合腹膜及皮肤，给予尾注青霉素8万单位预防感染，并用温水纱布保护动物切口，脊髓缺血再灌注损伤模型完成后进行观察。
3、检查指标
指标检查从神经功能评价和组织病理学观察两方面检测。
3.1神经功能评价
再灌注后48h后对三组脊髓缺血再灌注损伤模型进行后肢神经功能评分。评分等级指标如下表所示（表2）：
表2 神经功能评分等级指标
3.2组织学观察
组织学检测兔再灌注48h后切除L2～4椎板，充分显露L3～4节段硬脊膜，切断周围神经根，剪开硬脊膜，将同一节段脊髓取出，置4%多聚甲醛溶液中固定。将固定组织制病理切片，HE染色，光镜下观察。
4、统计方法
采用SPSS13.5统计软件统计软件实验数据，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，等级资料采用秩和检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。
5、结果
5.1一般情况
实验兔的存活率为100%，所有实验动物无一例死于麻醉相关并发症，整个实验过程中所有动物体温均维持于正常水平，各组动物血压及心率无明显变化。
5.2神经功能评价
再灌注后48h后观察兔双后肢运动功能显示：B、C、D各组与A组（活动无异常）比较有明显差异。B组缺血30min再灌注48h后均出现不同程度的双后肢瘫痪且神经功能出现明显障碍，在神经行为学评分上与A组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）。C组与B组比较稍轻，只是部分出现后肢瘫痪的状况，在神经功能评分上比较，差异有统计学意义（P<0.05）。各组兔神经行为学评分结果见表3。
表3 神经行为学评分频数表
5.3组织病理学观察
A组再灌注48h后光镜下可见神经元胞体边缘清晰，细胞核位于中央且轮廓清晰光滑，细胞呈多极形，核仁无变化，组织无水肿与出血等异常表现。B组再灌注48h后光镜下可见神经元细胞明显肿胀，结构模糊不清晰，细胞核变浅，脊髓前角正常运动神经元细胞稀少，出现神经细胞坏死，留下死腔。细胞质出现肿胀，纤维排列不规则；C组再灌注48h后光镜下可见出现轻微的血管充血，较少出现神经元细胞固缩、形态结构改变，
6、讨论
6.1脊髓缺血再灌注损伤是指导致脊髓组织在缺血的因素去除后，脊髓组织恢复正常的血供，但脊髓神经功能不但得不到明显改善，反而在原脊髓组织缺血损伤的基础上进一步加重，因此，经处理恢复血流后损伤反而加重的现象称为脊髓缺血再灌注损伤。脊髓缺血再灌注损伤是在临床上常见的一种损伤，近20年来人们对脊髓损伤的病因及机制进行了大量的基础研究和临床观察，但迄今仍是医学上一大难题。
6.2脊髓缺血再灌注损伤究其原因是多因素引起的不可逆性损伤，是原发性脊髓损伤后的继发性损害。可能与血流恢复后脊髓组织的氧自由基过多产生、细胞凋亡加重等有关。能量代谢障碍、氧自由基与钙离子超载等因素在脊髓缺血再灌注损伤中起主要作用。脊髓缺血再灌注损伤过程中大量多聚不饱和脂肪酸存在脊髓组织中，在氧化损伤中十分敏感，氧自由基有较强的氧化性，进而引起脂质过氧化，产生神经炎症，使脊髓发生继发性损伤，导致神经细胞变性、坏死或凋亡。
6.3本实验结果显示C组神经功能障碍减轻，后肢瘫痪也有所改善。病理组织学观察C组神经元细胞损伤较正常饮食组减轻。这些说明生酮饮食对兔脊髓缺血再灌注损伤有保护作用。生酮饮食（KD）使机体能够利用脂肪代谢产生的酮体作为能量来源，可以产生抗惊厥、抗癫痫作用。它模拟了人体饥饿的状态，在糖利用受到限制时酮体成为主要能量来源。研究表明，KD具有抗神经细胞凋亡和抗氧化作用，同时KD及其代谢产物酮体对许多神经系统疾病均具有控制症状及防止疾病发展的作用。另一方面，富含脂肪酸的KD还可以明显减轻神经系统损伤后的炎症反应。实验结果表明，KD明显减轻兔脊髓缺血再灌注损伤引起的神经元损伤，为脊髓缺血再灌注损伤进一步的防治研究提供了依据。