【摘 要】
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目的建立酸碱"一步法"荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸。方法对建立的酸碱"一步法"荧光PCR中的核酸释放剂组分及其浓度、释放时间,PCR缓冲液的组分
【机 构】
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武汉大学医院检验科,武汉大学基础医学院,武汉百泰基因工程有限公司,湖北工业大学生物工程学院工业发酵湖北省协同创新中心,
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目的建立酸碱"一步法"荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸。方法对建立的酸碱"一步法"荧光PCR中的核酸释放剂组分及其浓度、释放时间,PCR缓冲液的组分、p H值及防污染体系进行优化。验证该方法的灵敏度及线性范围,与同类试剂盒进行比较,并应用于其他病原体的检测。结果最佳核酸释放剂为:0.4 mol/L KOH,0.3%十二烷基硫酸锂(lithium lauryl sulphate,LLS),0.3%Triton X-100,0.02%Foam Ban和0.5%N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC);最佳PCR缓冲液组分如下:0.5 mol/L Tris-醋酸(p H 7.4),1%甘油,2.5%海藻糖,1 mol/L KCl,0.5 mol/L Mg Cl2,10 mmol/L EDTA、0.2%BSA和0.01%NaN3。建立的方法的最低检测量达1×10~2copies/ml,在1×10~2~1×10~9 copies/ml范围内参考品浓度与Ct值呈良好线性关系,回归方程为:y=-3.36 x+39.469 9,R2=0.999 9。该方法与同类试剂盒的检测结果差异无统计学意义(P>0.05),不能用于检测解脲脲原体。结论酸碱"一步法"荧光PCR可用于HBV核酸的快速检测,该方法操作简便、快速,抗污染及干扰能力强,具有较高的临床应用价值。
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