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摘要 介绍了一种利用棉花种子通用DNA快速提取方法以及多重PCR技术实现其纯度快速检测的技术。由于该技术具备准确、高效、成本低，以及便于推广应用的特点，实现了棉花种子纯度的快速检测。
关键词 棉花种子；PCR；快速检测
中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）07-0056-01
棉花是我国重要经济作物之一，对我国农业生产的发展发挥了重要促进作用。自我国成功加入WTO组织之后，棉花出口量逐年递增，对其产量、品质均提出了更高的要求。棉花的种子是棉花生产的基础，种子纯度是衡量质量的主要标准，棉种质量的高低是决定该品种能否在生产上推广、应用的前提，也是棉种生产及其推广应用的生命线[1-2]。种子纯度作为衡量棉花种子的重要指标之一，不仅影响着企业对于棉种的购销，也是企业能否稳健发展的根本。如何及时准确地鉴定出棉种的纯度，一直是棉种行业质量监控的重点和难点。纯度鉴定是判定种子质量最复杂的检验过程。种子纯度检测的方法有很多，传统鉴定方法为等到种子下一个生长季节或者到海南省通过种植鉴定，该方法的缺点在于费时费力，且成本较高，无法满足现代化种子经营的步伐[3-4]。随着DNA标记技术的逐步成熟，目前已成为鉴定棉花杂家种子纯度鉴定方法的补充或有效替代[5-6]。
哈密地处亚欧大陆腹地，位于西风带控制之下，常年干燥少雨，温差大，光照时间长，热量丰富，属于典型的大陆性半干旱气候，对棉花等种植业的发展极为有利，在新疆棉花气候资源区划上属宜棉区。得天独厚的自然条件，吸引了诸多内地厂家来此繁育棉花。在杂交棉花的制种方面，目前多通过人工去雄授粉方法进行，其缺点表现为难免会出现一部分自交现象，导致该现象的诱因有多种：首先是人工去雄不到位，即由于天气或劳动力等因素所限，导致去雄不彻底；其次是种子纯度不高，部分种子经销商在利益驱使下，在种子中掺杂假种子，严重影响种子纯度；最后，由于棉花自身具备一定天然异交率，容易造成品种混乱。对于棉花生产来说，如果不能有效鉴定棉种的纯度，将严重影响棉花产量及品质。因此，如果能够探索出一种精准、高效、经济的棉种纯度检测技术，可对杂交棉的种植及推广起到积极的促进作用[7-8]。
本文通过将棉花种子DNA快速提取方法和通用多重PCR技术结合起来，实现提高棉花种子纯度鉴定效率的同时，也极大地提升新疆生产建设兵团第十三师农业科学研究所科研技术服务能力，对促进哈密地区及十三师现代化农业健康、持续发展有着重要的意义。现将棉花种子纯度快速检测技术研究的具体实施方案介绍如下。
1 引物设计
根据Cotton Microsatellite Database（CMD）已公布的序列，以及两端序列的保守性，设计多对引物。在设计引物的过程中，要充分考虑引物的差异性、Tm值、长度、GC含量等。
2 DNA提取方法
本试验采用改良的CTAB法提、SDS法、试剂盒快速提取法分别提取棉花种仁和子叶DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，分光光度法测定DNA浓度和纯度，筛选出最优的提取部位和提取方法。建立一种基于PCR的棉花种子DNA快速提取方法，并经过多组试验，深入研究提取方法所涉及因素（如提取液体积、浓度、提取时间等）对DNA完整性以及PCR产物的影响，以及不同公司的Mix以及DNA模板量存在差异性的情况下对PCR产物的影响，最终研究出一种基于PCR的棉花种子DNA快速提取方法。
3 多重PCR技术
通过深入研究多重PCR技术，多方面、多维度对引物设计、PCR扩增体系以及PCR扩增程序进行深入思考，并对其技术可行性进行缜密论证，最终建立起一套通用多重PCR技术。
4 扩增产物的PAGE与银染检测
经过PCR扩增完成并且经过变性以后，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，随后进行银染检测，再根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的带型统计母本自交粒带型数量、待测样品目标带型数量，以及杂粒带型数量，最终计算出待测样品的纯度，亦可根据其他PCR产物检测仪器的参数计算待测样品纯度[9-11]。
5 参考文献
[1] 刘勤红，王芙蓉，张军，等.利用SSR标记鉴定鲁棉研15号杂交种纯度的研究[J].山东农业科学，2003（2）：7.
[2] 陈一华，张超良，王泽立，等.玉米种子的DNA指纹计算机化鉴定[J].应用与环境生物学报，2000，6（3）：223.
[3] 郭小平，赵元明，刘毓侠.SSR技术在植物遗传育种中的应用[J].华北农学报，1998，13（3）：213.
[4] 梅眉，陆璐.DNA分子标记技术在农作物种子质量检验中的应用[J].分子植物育种，2005，3（1）：129.
[5] 倪西源，王学德，程超华，等.棉花分子标记图谱的构建和一些重要性状的定位[J].棉花学报，2007，19（1）：71.
[6] 朱美霞，李英芝，王建书，等.利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J].安徽农业科学，2005，33（11）：2010.
[7] 叶磊，于茜.一种适于SSR-PcR的棉花基因组DNA提取法[J].分子植物育种，2007，5（5）：738.
[8] 郭瑞星，刘小红，荣廷昭，等.植物SSR标记的发展及其在遗传育种中的应用[J].玉米科学，2005，13（2）：8-11.
[9] 陈浩东.湘杂棉SSR指纹图谱构建及种子纯度检测的研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.
[10] 辛景树，赵建宗，张春庆.棉花种子纯度电泳检测及品种数据库建立[J].中国种业，2003（8）：7-9.
[11] 张灿，吴照华，汪莲莲，等.应用SSR标记方法检测棉花种子纯度[J].中国棉花，2012（8）：31-32.
关键词 棉花种子；PCR；快速检测
中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）07-0056-01
棉花是我国重要经济作物之一，对我国农业生产的发展发挥了重要促进作用。自我国成功加入WTO组织之后，棉花出口量逐年递增，对其产量、品质均提出了更高的要求。棉花的种子是棉花生产的基础，种子纯度是衡量质量的主要标准，棉种质量的高低是决定该品种能否在生产上推广、应用的前提，也是棉种生产及其推广应用的生命线[1-2]。种子纯度作为衡量棉花种子的重要指标之一，不仅影响着企业对于棉种的购销，也是企业能否稳健发展的根本。如何及时准确地鉴定出棉种的纯度，一直是棉种行业质量监控的重点和难点。纯度鉴定是判定种子质量最复杂的检验过程。种子纯度检测的方法有很多，传统鉴定方法为等到种子下一个生长季节或者到海南省通过种植鉴定，该方法的缺点在于费时费力，且成本较高，无法满足现代化种子经营的步伐[3-4]。随着DNA标记技术的逐步成熟，目前已成为鉴定棉花杂家种子纯度鉴定方法的补充或有效替代[5-6]。
哈密地处亚欧大陆腹地，位于西风带控制之下，常年干燥少雨，温差大，光照时间长，热量丰富，属于典型的大陆性半干旱气候，对棉花等种植业的发展极为有利，在新疆棉花气候资源区划上属宜棉区。得天独厚的自然条件，吸引了诸多内地厂家来此繁育棉花。在杂交棉花的制种方面，目前多通过人工去雄授粉方法进行，其缺点表现为难免会出现一部分自交现象，导致该现象的诱因有多种：首先是人工去雄不到位，即由于天气或劳动力等因素所限，导致去雄不彻底；其次是种子纯度不高，部分种子经销商在利益驱使下，在种子中掺杂假种子，严重影响种子纯度；最后，由于棉花自身具备一定天然异交率，容易造成品种混乱。对于棉花生产来说，如果不能有效鉴定棉种的纯度，将严重影响棉花产量及品质。因此，如果能够探索出一种精准、高效、经济的棉种纯度检测技术，可对杂交棉的种植及推广起到积极的促进作用[7-8]。
本文通过将棉花种子DNA快速提取方法和通用多重PCR技术结合起来，实现提高棉花种子纯度鉴定效率的同时，也极大地提升新疆生产建设兵团第十三师农业科学研究所科研技术服务能力，对促进哈密地区及十三师现代化农业健康、持续发展有着重要的意义。现将棉花种子纯度快速检测技术研究的具体实施方案介绍如下。
1 引物设计
根据Cotton Microsatellite Database（CMD）已公布的序列，以及两端序列的保守性，设计多对引物。在设计引物的过程中，要充分考虑引物的差异性、Tm值、长度、GC含量等。
2 DNA提取方法
本试验采用改良的CTAB法提、SDS法、试剂盒快速提取法分别提取棉花种仁和子叶DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，分光光度法测定DNA浓度和纯度，筛选出最优的提取部位和提取方法。建立一种基于PCR的棉花种子DNA快速提取方法，并经过多组试验，深入研究提取方法所涉及因素（如提取液体积、浓度、提取时间等）对DNA完整性以及PCR产物的影响，以及不同公司的Mix以及DNA模板量存在差异性的情况下对PCR产物的影响，最终研究出一种基于PCR的棉花种子DNA快速提取方法。
3 多重PCR技术
通过深入研究多重PCR技术，多方面、多维度对引物设计、PCR扩增体系以及PCR扩增程序进行深入思考，并对其技术可行性进行缜密论证，最终建立起一套通用多重PCR技术。
4 扩增产物的PAGE与银染检测
经过PCR扩增完成并且经过变性以后，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，随后进行银染检测，再根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的带型统计母本自交粒带型数量、待测样品目标带型数量，以及杂粒带型数量，最终计算出待测样品的纯度，亦可根据其他PCR产物检测仪器的参数计算待测样品纯度[9-11]。
5 参考文献
[1] 刘勤红，王芙蓉，张军，等.利用SSR标记鉴定鲁棉研15号杂交种纯度的研究[J].山东农业科学，2003（2）：7.
[2] 陈一华，张超良，王泽立，等.玉米种子的DNA指纹计算机化鉴定[J].应用与环境生物学报，2000，6（3）：223.
[3] 郭小平，赵元明，刘毓侠.SSR技术在植物遗传育种中的应用[J].华北农学报，1998，13（3）：213.
[4] 梅眉，陆璐.DNA分子标记技术在农作物种子质量检验中的应用[J].分子植物育种，2005，3（1）：129.
[5] 倪西源，王学德，程超华，等.棉花分子标记图谱的构建和一些重要性状的定位[J].棉花学报，2007，19（1）：71.
[6] 朱美霞，李英芝，王建书，等.利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J].安徽农业科学，2005，33（11）：2010.
[7] 叶磊，于茜.一种适于SSR-PcR的棉花基因组DNA提取法[J].分子植物育种，2007，5（5）：738.
[8] 郭瑞星，刘小红，荣廷昭，等.植物SSR标记的发展及其在遗传育种中的应用[J].玉米科学，2005，13（2）：8-11.
[9] 陈浩东.湘杂棉SSR指纹图谱构建及种子纯度检测的研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.
[10] 辛景树，赵建宗，张春庆.棉花种子纯度电泳检测及品种数据库建立[J].中国种业，2003（8）：7-9.
[11] 张灿，吴照华，汪莲莲，等.应用SSR标记方法检测棉花种子纯度[J].中国棉花，2012（8）：31-32.