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摘要：目的 观察通脉地仙丸对大鼠缺血心肌血管生成及其相关基因表达的影响。方法 除假手术组外，大鼠进行慢性心肌缺血造模，造模成功后，随机分为模型组、麝香保心丸组与通脉地仙高、中、低剂量组，各组灌胃给药，6周后采用免疫组化法检测心肌组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）蛋白含量，并观察VEGF、bFGF mRNA的表达。结果 与假手术组比较，模型组、通脉地仙丸各剂量组和麝香保心丸组bFGF、VEGF蛋白表达上调（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；与模型组比较，通脉地仙各剂量组和麝香保心丸组bFGF、VEGF蛋白表达均上调（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；与假手术组比较，模型组、麝香保心丸组和通脉地仙高、中剂量组VEGF、bFGF mRNA表达上调（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，通脉地仙高、中剂量组和麝香保心丸组VEGF、bFGF mRNA表达均上调（P<0.01，P<0.001）。结论 通脉地仙丸对大鼠缺血心肌血管生成的影响与血管内皮生长因子VEGF、bFGF相关，且发挥重要作用。
关键词：通脉地仙丸；血管内皮细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；心肌缺血；大鼠
对肿瘤的研究，随后，人们对血管生成因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行了广泛而深入的研究，认识到血管生成不仅在肿瘤的生长和扩散中有重要作用，在冠心病等缺血性疾病的生理和病理中也同样有着重要的作用[1-2]。本实验主要观察通脉地仙丸作用于大鼠心肌缺血模型后，VEGF、bFGF蛋白及相关基因表达的变化，从而阐明通脉地仙丸抗心肌缺血损伤的作用机制与VEGF和bFGF基因表达的关系。
1 实验材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠100只，体质量（240±20）g，吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（吉）2007-0003。
1.2 药物
通脉地仙丸由深圳市中医院提供，批号：粤Z20070568；麝香保心丸由上海和黄药业有限公司生产，批号100507；青霉素由华北制药股份有限公司生产，批号Y1003401；羧甲基纤维素钠由上海三浦化工有限公司生产，批号20100715。
1.3 试剂
甲醛，沈阳市东兴试剂厂提供，批号0080818；SP-9710试剂盒和DAB试剂盒福州迈新生物技术开发有限公司生产；抗VEGF、抗bFGF抗体均由北京博奥森生物技术有限公司提供；引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成；DEPC水、RNA反转录试剂盒和DNA聚合酶均由大连百奥泰生物技术有限公司提供；DNA Marker、10×loading buffer（DNA）由北京鼎国昌盛生物技术有限公司提供；琼脂糖，美国Sigma公司产品。
1.4 仪器
心电图机（ECG-6511），上海光电医用电子仪器有限公司；BX51光学显微镜，日本OLYPUS公司；微量移液器，芬兰GILSON公司；RM 2245石蜡切片机、HI1210组织烘片机、HI1220组织摊片机及EG1150H组织包埋机均为德国LEICA公司；101A-2E电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司生产；DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Biofuge stratos低温高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[3]的方法复制心肌梗死模型。将大鼠用乙醚麻醉后仰位固定于手术台上，胸部备皮、消毒，使用10号线行荷包缝合，正中用手术刀切开，止血钳剥离肋间肌肉，在左侧3～4肋间开胸，显露心脏，于左心房与肺动脉圆锥间下2～3 mm处找到冠状动脉左前降支，用0号线立即结扎，然后将心脏放回胸腔，将胸腔内气体迅速挤出并拉紧荷包缝合线进行结扎，关闭胸腔，开胸时间全程不超过30 s，假手术组只将手术线打一松结。以结扎线以下心肌颜色变苍白、搏动减弱，心电图S-T段明显抬高为造模成功标志，术后1周注射青霉素预防感染。
2.2 分组与给药
2.3 大鼠心肌组织免疫组织化学检测
5 讨论
研究表明，新血管的生成在缺血心肌建立有效的侧支循环中起着极为重要的作用，因此促血管生成的细胞生长因子则成为研究者们普遍关注的热点，尤其近年来分子生物学技术的不断提高，不仅证实了缺血或梗死是局部心肌血管新生、形成侧枝循环的一个启动因素，并逐渐开始阐明，血管生成是由多基因表达调控、多因子参与的复杂过程[4]。
VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原，属分泌性的糖蛋白，有促进内皮增生、增强血管通透性、加速新血管形成的作用[5]。血管生长在生理情况下一般是比较稳定的，只有在不利因素刺激下（例如组织缺血缺氧、炎症、肿瘤等）才会破坏原有的稳态，激活血管的新生。现已知具有潜在促血管生成的因子有VEGF、bFGF、胰岛素生长因子（IGF-1）、上皮生长因子（EGF）、转移生长因子（TGF-α）、胎盘生长因子（PIGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板源生长因子（PDGF）和血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）等，目前功能比较明确的促血管生
成的因子是VEGF和bFGF。相关的细胞因子中以VEGF、bFGF的研究最为确切[1]，在血管新生过程中起着关键性的作用。
VEGF为特异性内皮细胞丝裂原，是作用于血管内皮细胞的强有力的多功能细胞因子，能促进内皮细胞的增殖、迁移，影响内皮细胞的基因表达，刺激内皮细胞分泌组织因子、蛋白酶和胶原酶，组织因子和胶原酶可以改变内皮细胞的细胞外基质，有利于血管形成[5-6]。蛋白酶则可以降解细胞外基质，有利于使已经结合在细胞外基质上的VEGF和FGF的释放[7]。VEGF特异性作用于靶细胞——血管内皮细胞，具有一定的特异性，在正常的心肌组织中，也会有少量的VEGF存在，它主要存在于上皮和心肌细胞的胞浆。在心肌组织缺血缺氧情况下，组织中的VEGF的表达量将会增加，特别是在缺血的左心室表达更为显著[8]。同时研究表明，bFGF作为一种多功能的细胞生长因子，在胚胎发育、创伤修复以及缺血、炎症、肿瘤等情况下，可通过某种释放机制，特异地作用于血管的EC细胞，刺激其增殖，促进血管生成，有显著促进血管侧枝循环的作用[9]，进而改善人体组织器官的血液供应[10-11]。普遍认为，血管新生的早期，bFGF对微血管新生起促进作用，而由VEGF完成更持续的促血管新生作用，另外，当VEGF严重不足时，会导致血管腔闭合和血管退化消失。基于上述阐述，一些基因治疗和促进相关基因生成的药物已在缺血性疾病中治疗表现出独有的优势。 基因治疗在动物实验及临床研究上已经取得明显的效果，通过输入外源性促血管生长因子达到促进缺血心脏侧支循环的建立，改善心肌缺血，防治心肌梗死目的，用于治疗或辅助治疗缺血性心脏病成为近年来研究的热点之一[12-13]。中医学则依据益气生血、活血生肌理论，通过活血中药组分可以促进血管新生的作用达到促进缺血区侧枝循环形成。王氏等[14]通过复方芪丹通脉片应用于急性心肌缺血大鼠的实验，发现其具有增加MVD和VEGF蛋白表达、缩小心肌梗死面积范围的作用。脑缺血后，梗死灶边缘VEGF表达明显增高和毛细血管计数增加，从而起到脑保护作用，同时改善梗死边缘区的微循环、促进功能恢复[15]。因此基因治疗缺血性疾病，将在未来发挥重要医用价值。
本实验对各组心肌缺血样本进行了特异性的促血管生长因子VEGF和bFGF免疫组织化学染色。研究发现，给药组大鼠心肌梗死区这两种血管生长因子的蛋白表达呈上调的趋势。这可能是因为心肌缺血缺氧后，局部缺血缺氧因素刺激激活了体内的血管新生机制，使缺血梗死边缘区促血管新生因子占优势，从而促使新生血管出现，提示这两种血管生长因子在促进血管新生中起着十分重要的作用。另外，实验研究中应用PCR基因扩增技术发现，给药组的VEGF mRNA和bFGF mRNA相对表达也呈现相同的趋势，故笔者认为，给药组是通过提高VEGF和bFGF的基因表达实现促进血管新生的目的。
参考文献：
[1] 卞修武.血管生成、治疗性血管生成和抗血管生成[J].第三军医大学学报，2001，23（3）：249-250.
[2] 袁胜涛，萧东，丁健.抗血管生成药物筛选和研究的体内外模型[J].国外医学：药学分册，2000，27（4）：204-208.
[3] 王振涛，王硕仁，赵明镜，等.活血和益气方药对心肌梗死后左心衰大鼠左心室重构影响的比较研究[J].中国中西医结合杂志，2002，22（5）：376-378.
[4] 张腾，曹洪欣，陈瑜，等.温心胶囊对大鼠缺血心肌血管生成及其相关基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2003，23（S1）：4-7.
[5] Corvol P. VEGF， anti-VEGF and diseases[J]. Bull Acad Natl Med， 2008，192（2）：289-303.
[6] Roodhart JM， Langenberg MH， Witteveen E， et al. The molecular basis of class side effects due to treatment with inhibitors of the VEGF/VEGFR pathway[J]. Curr Clin Pharmacol，2008，3（2）：132-143.
[7] 尹慧秋，张继东，林海青，等.舒脉胶囊对大鼠缺血心肌促血管新生的影响[J].中国中西医结合杂志，2007，27（11）：1020-1022.
[8] Sellke FW， Wang SY， Stamler A， et al. Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcine myocardium[J]. Am J pliysiol，1996，271（2pt2）：H713.
[9] Wafai R， Tudor EM， Angus JA， et al. Vascular effects of FGF-2 and VEGF-β in rabbits with bilateral hind limb ischemia[J]. J Vasc Res，2009，46（1）：45-54.
[10] Buehler A， Martire A， Strohm C， et al. Angiogenesis-independent cardioprotection in FGF-1 transgenic mice[J]. Cardiovasc Res， 2002，55（4）：768-777.
[11] Hoffmann S， Friedrichs U， Eichler W， et al. Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation， matrix metalloproteinase-2 and VEGF upregulation in vitro[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002，240（12）：996-1002.
[12] Ferraro B， Cruz YL， Baldwin M， et al. Increased perfusion and angiogenesis in a hindlimb ischemia model with plasmid FGF-2 delivered by noninvasive electroporation[J]. Gene Ther，2010， 17（6）：763-769.
（收稿日期：2012-07-27，编辑：华强）
关键词：通脉地仙丸；血管内皮细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；心肌缺血；大鼠
对肿瘤的研究，随后，人们对血管生成因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行了广泛而深入的研究，认识到血管生成不仅在肿瘤的生长和扩散中有重要作用，在冠心病等缺血性疾病的生理和病理中也同样有着重要的作用[1-2]。本实验主要观察通脉地仙丸作用于大鼠心肌缺血模型后，VEGF、bFGF蛋白及相关基因表达的变化，从而阐明通脉地仙丸抗心肌缺血损伤的作用机制与VEGF和bFGF基因表达的关系。
1 实验材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠100只，体质量（240±20）g，吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（吉）2007-0003。
1.2 药物
通脉地仙丸由深圳市中医院提供，批号：粤Z20070568；麝香保心丸由上海和黄药业有限公司生产，批号100507；青霉素由华北制药股份有限公司生产，批号Y1003401；羧甲基纤维素钠由上海三浦化工有限公司生产，批号20100715。
1.3 试剂
甲醛，沈阳市东兴试剂厂提供，批号0080818；SP-9710试剂盒和DAB试剂盒福州迈新生物技术开发有限公司生产；抗VEGF、抗bFGF抗体均由北京博奥森生物技术有限公司提供；引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成；DEPC水、RNA反转录试剂盒和DNA聚合酶均由大连百奥泰生物技术有限公司提供；DNA Marker、10×loading buffer（DNA）由北京鼎国昌盛生物技术有限公司提供；琼脂糖，美国Sigma公司产品。
1.4 仪器
心电图机（ECG-6511），上海光电医用电子仪器有限公司；BX51光学显微镜，日本OLYPUS公司；微量移液器，芬兰GILSON公司；RM 2245石蜡切片机、HI1210组织烘片机、HI1220组织摊片机及EG1150H组织包埋机均为德国LEICA公司；101A-2E电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司生产；DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Biofuge stratos低温高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[3]的方法复制心肌梗死模型。将大鼠用乙醚麻醉后仰位固定于手术台上，胸部备皮、消毒，使用10号线行荷包缝合，正中用手术刀切开，止血钳剥离肋间肌肉，在左侧3～4肋间开胸，显露心脏，于左心房与肺动脉圆锥间下2～3 mm处找到冠状动脉左前降支，用0号线立即结扎，然后将心脏放回胸腔，将胸腔内气体迅速挤出并拉紧荷包缝合线进行结扎，关闭胸腔，开胸时间全程不超过30 s，假手术组只将手术线打一松结。以结扎线以下心肌颜色变苍白、搏动减弱，心电图S-T段明显抬高为造模成功标志，术后1周注射青霉素预防感染。
2.2 分组与给药
2.3 大鼠心肌组织免疫组织化学检测
5 讨论
研究表明，新血管的生成在缺血心肌建立有效的侧支循环中起着极为重要的作用，因此促血管生成的细胞生长因子则成为研究者们普遍关注的热点，尤其近年来分子生物学技术的不断提高，不仅证实了缺血或梗死是局部心肌血管新生、形成侧枝循环的一个启动因素，并逐渐开始阐明，血管生成是由多基因表达调控、多因子参与的复杂过程[4]。
VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原，属分泌性的糖蛋白，有促进内皮增生、增强血管通透性、加速新血管形成的作用[5]。血管生长在生理情况下一般是比较稳定的，只有在不利因素刺激下（例如组织缺血缺氧、炎症、肿瘤等）才会破坏原有的稳态，激活血管的新生。现已知具有潜在促血管生成的因子有VEGF、bFGF、胰岛素生长因子（IGF-1）、上皮生长因子（EGF）、转移生长因子（TGF-α）、胎盘生长因子（PIGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板源生长因子（PDGF）和血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）等，目前功能比较明确的促血管生
成的因子是VEGF和bFGF。相关的细胞因子中以VEGF、bFGF的研究最为确切[1]，在血管新生过程中起着关键性的作用。
VEGF为特异性内皮细胞丝裂原，是作用于血管内皮细胞的强有力的多功能细胞因子，能促进内皮细胞的增殖、迁移，影响内皮细胞的基因表达，刺激内皮细胞分泌组织因子、蛋白酶和胶原酶，组织因子和胶原酶可以改变内皮细胞的细胞外基质，有利于血管形成[5-6]。蛋白酶则可以降解细胞外基质，有利于使已经结合在细胞外基质上的VEGF和FGF的释放[7]。VEGF特异性作用于靶细胞——血管内皮细胞，具有一定的特异性，在正常的心肌组织中，也会有少量的VEGF存在，它主要存在于上皮和心肌细胞的胞浆。在心肌组织缺血缺氧情况下，组织中的VEGF的表达量将会增加，特别是在缺血的左心室表达更为显著[8]。同时研究表明，bFGF作为一种多功能的细胞生长因子，在胚胎发育、创伤修复以及缺血、炎症、肿瘤等情况下，可通过某种释放机制，特异地作用于血管的EC细胞，刺激其增殖，促进血管生成，有显著促进血管侧枝循环的作用[9]，进而改善人体组织器官的血液供应[10-11]。普遍认为，血管新生的早期，bFGF对微血管新生起促进作用，而由VEGF完成更持续的促血管新生作用，另外，当VEGF严重不足时，会导致血管腔闭合和血管退化消失。基于上述阐述，一些基因治疗和促进相关基因生成的药物已在缺血性疾病中治疗表现出独有的优势。 基因治疗在动物实验及临床研究上已经取得明显的效果，通过输入外源性促血管生长因子达到促进缺血心脏侧支循环的建立，改善心肌缺血，防治心肌梗死目的，用于治疗或辅助治疗缺血性心脏病成为近年来研究的热点之一[12-13]。中医学则依据益气生血、活血生肌理论，通过活血中药组分可以促进血管新生的作用达到促进缺血区侧枝循环形成。王氏等[14]通过复方芪丹通脉片应用于急性心肌缺血大鼠的实验，发现其具有增加MVD和VEGF蛋白表达、缩小心肌梗死面积范围的作用。脑缺血后，梗死灶边缘VEGF表达明显增高和毛细血管计数增加，从而起到脑保护作用，同时改善梗死边缘区的微循环、促进功能恢复[15]。因此基因治疗缺血性疾病，将在未来发挥重要医用价值。
本实验对各组心肌缺血样本进行了特异性的促血管生长因子VEGF和bFGF免疫组织化学染色。研究发现，给药组大鼠心肌梗死区这两种血管生长因子的蛋白表达呈上调的趋势。这可能是因为心肌缺血缺氧后，局部缺血缺氧因素刺激激活了体内的血管新生机制，使缺血梗死边缘区促血管新生因子占优势，从而促使新生血管出现，提示这两种血管生长因子在促进血管新生中起着十分重要的作用。另外，实验研究中应用PCR基因扩增技术发现，给药组的VEGF mRNA和bFGF mRNA相对表达也呈现相同的趋势，故笔者认为，给药组是通过提高VEGF和bFGF的基因表达实现促进血管新生的目的。
参考文献：
[1] 卞修武.血管生成、治疗性血管生成和抗血管生成[J].第三军医大学学报，2001，23（3）：249-250.
[2] 袁胜涛，萧东，丁健.抗血管生成药物筛选和研究的体内外模型[J].国外医学：药学分册，2000，27（4）：204-208.
[3] 王振涛，王硕仁，赵明镜，等.活血和益气方药对心肌梗死后左心衰大鼠左心室重构影响的比较研究[J].中国中西医结合杂志，2002，22（5）：376-378.
[4] 张腾，曹洪欣，陈瑜，等.温心胶囊对大鼠缺血心肌血管生成及其相关基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2003，23（S1）：4-7.
[5] Corvol P. VEGF， anti-VEGF and diseases[J]. Bull Acad Natl Med， 2008，192（2）：289-303.
[6] Roodhart JM， Langenberg MH， Witteveen E， et al. The molecular basis of class side effects due to treatment with inhibitors of the VEGF/VEGFR pathway[J]. Curr Clin Pharmacol，2008，3（2）：132-143.
[7] 尹慧秋，张继东，林海青，等.舒脉胶囊对大鼠缺血心肌促血管新生的影响[J].中国中西医结合杂志，2007，27（11）：1020-1022.
[8] Sellke FW， Wang SY， Stamler A， et al. Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcine myocardium[J]. Am J pliysiol，1996，271（2pt2）：H713.
[9] Wafai R， Tudor EM， Angus JA， et al. Vascular effects of FGF-2 and VEGF-β in rabbits with bilateral hind limb ischemia[J]. J Vasc Res，2009，46（1）：45-54.
[10] Buehler A， Martire A， Strohm C， et al. Angiogenesis-independent cardioprotection in FGF-1 transgenic mice[J]. Cardiovasc Res， 2002，55（4）：768-777.
[11] Hoffmann S， Friedrichs U， Eichler W， et al. Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation， matrix metalloproteinase-2 and VEGF upregulation in vitro[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002，240（12）：996-1002.
[12] Ferraro B， Cruz YL， Baldwin M， et al. Increased perfusion and angiogenesis in a hindlimb ischemia model with plasmid FGF-2 delivered by noninvasive electroporation[J]. Gene Ther，2010， 17（6）：763-769.
（收稿日期：2012-07-27，编辑：华强）