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摘 要 为研究菠萝蜜多糖（JFP-Ps）在体外模拟胃肠消化过程中抗氧化活性变化规律，通过模拟人体胃肠道消化模型，测定JFP-Ps体外消化产物对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）以及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical， DPPH·）的清除能力。研究结果表明，经体外胃肠消化的JFP-Ps产物具有较强的·OH、O2-·和DPPH·清除能力。在模拟唾液消化15 min时，消化产物具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性；在模拟胃液消化4 h时，JFP-Ps有最大的·OH清除活性，而在模拟胃液1 h时有最大的O2-·和DPPH·清除活性；在模拟小肠液消化8 h时，消化产物具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性，说明JFP-Ps经过体外模拟消化后仍然具有较强的·OH清除活性，且对其抗氧化活性具有促进作用。
关键词 菠萝蜜多糖 ；体外消化 ；抗氧化活性 ；清除自由基
中图分类号 Q964.3 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.013
Abstract An attempt was made to investigate the change of the antioxidant activities of polysaccharides from jackfruit （Artocarpus heterophyllus Lam） pulps （JFP-Ps） during simulated gastrointestinal digestion in vitro. The antioxidant activities of the digested products of JFP-Ps， including hydroxyl radical （·OH） scavenging capacity， superoxide anion radical （O2-·） scavenging capacity and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH·） radical scavenging activity， were evaluated by simulating the digestion of human gastrointestinal tract in vitro. The evaluation found that during simulated gastrointestinal digestion in vitro the digested products of JFP-Ps had the ability of scavenging activities towards ·OH， O2-· and DPPH· radicals. When saliva digestion was simulated for 15min， the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities. When gastric digestion was simulated for 4 h， the digested products had the highest ·OH radical scavenging activities， while the highest O2-· and DPPH· radical scavenging activities were observed when gastric digestion was simulated for 1 h. And the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities when small intestinal digestion was simulated for 8 h. The results showed that after simulation of digestion in vitro JFP-Ps still exhibited strong ·OH radical scavenging activities and that their antioxidant activities were promoted.
Keywords polysaccharides from Artocarpus heterophyllus Lam. Pulp； digestion in vitro； antioxidant activity ； radical scavenging
多糖是由十個以上的单糖通过直链或支链糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，广泛存在于植物、动物和微生物中。目前，大量学者对多种多糖的体外消化进行了广泛研究，主要集中于多糖在消化模型中的性质变化、生物活性变化以及结构变化。梅娜娜等[1]研究发现，金钗石斛多糖在体外模拟消化过程中分子量降低，还原糖含量上升，但并未检测到单糖。Hu和ding等[2-3]分别研究了大粒车前子多糖和灵芝多糖在体外模拟胃肠道消化模型中的消化作用，发现他们的分子量均降低。红江蓠多糖、茯砖茶多糖和茶花多糖在模拟唾液、胃和小肠消化条件下没有发生降解，分子量、单糖含量和还原糖含量无显著变化[4-6]。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）为桑科木菠萝属热带水果，种植于印度、孟加拉国、斯里兰卡和中国南部等国家和地区[7-8]。菠萝蜜具有抗氧化、抑菌抗炎、防龋、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节和伤口愈合作用等多种功能活性，这些活性可能归因于菠萝蜜含有多种有益的化学成分，包括多糖类化合物、黄酮类化合物，甾醇类化合物和异戊二烯基黄酮类化合物等[9-12]。近年来，有关菠萝蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）的报道主要集中在多糖的提取、理化性质以及生理活性等方面。Tan等[10]研究发现，菠萝蜜果肉中粗多糖具有免疫增强活性。朱科学等[12-13]优化了水提醇沉法提取JFP-Ps的工艺，研究发现，JFP-Ps得率为6.18%，含有79.12%的总糖、5.83%的蛋白质、15.65%的糖醛酸和15种氨基酸，且具有显著的体外抗氧化活性；研究还发现，JFP-Ps的免疫活性增强可能与其促进小鼠脾淋巴细胞增殖、提高抗氧化活性及诱导细胞因子 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β分泌有关。 体外消化模型是通过模拟体内消化生理条件研究食物的消化特性，已广泛应用于营养学、药理学和食品化学等领域。目前，利用体外模拟人体胃肠道消化模型研究生物活性物质消化后的抗氧化活性变化，已经成为体外模拟人体消化技术的最新趋势[14]。但有关JFP-Ps在体外消化模型中的抗氧化活性评价鲜有报道。因此，本实验旨在通过体外模拟唾液、胃液以及小肠液消化的方法，评价JFP-Ps在消化过程中的抗氧化活性变化情况，以期为JFP-Ps在营养健康产品研发和膳食指导方面提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
菠萝蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸组成，平均分子量为1668 kDa[11]，由香料饮料研究所产品加工研究课题组提供。
体外消化酶：胃蛋白酶（猪源）和胰酶（来源于猪胰腺）购自阿拉丁试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）购自美国Sigma公司；邻菲罗啉购自北京索莱宝科技有限公司；Tris（三羟甲基氨基甲烷）购自广州赛国生物科技有限公司；磷酸二氢钾，硫酸亚铁，邻苯三酚，无水乙醇，HCl和H2O2购自西陇科学股份有限公司；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自广州化学试剂厂。
1.1.2 仪器与设备
DK-98-IIA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司生产；SHZ-B水浴恒温振荡器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司生产；SPECORD 250PLUS紫外/可见分光光度仪，德国耶拿分析仪器股份公司生产；Master-s-plus UVF 全自动超纯水系统，上海和泰仪器有限仪器公司生产；AL 104电子天平、FE20 pH计，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
（1） JFP-Ps唾液消化研究
挑选健康的志愿者2人（年龄20～30岁），收集唾液前，志愿者禁止饮食和喝水，用水漱口30 s，以获得中性的环境。然后将唾液在口腔聚集，受试者每隔60 s将其吐入试管，收集好的唾液4 000×g离心10 min以去除细胞，收集上清液备用。
分别取2 mL唾液置于8组试管，各加2 mL JFP-Ps溶液（4.0 mg/mL），用封口膜封口，充分混匀，37℃水浴进行消化实验，分别在5、10、15 、20、30 min和1 h取样，样品置于沸水浴灭酶15 min，将消化液用蒸馏水稀释至1 mg/mL，于4 000 ×g离心10 min，取上清液-20℃保存备用，实验平行进行3次。
（2） JFP-Ps体外模拟胃液消化研究
参照中國药典方法配制人工胃液：取16.4 mL HCl于烧杯中，加800 mL蒸馏水和10 g胃蛋白酶，加水稀释至1 000 mL，用1 mol/L NaHCO3调pH至（1.3±0.1），4℃保存备用。
JFP-Ps样品溶液经唾液消化15 min后分别加入等体积的人工胃液4 mL，密闭环境下于37℃水浴进行胃液消化，分别在5、15、30 min、1 、2、4 h取出样品于沸水浴中灭酶15 min，冷却至室温，1 mol/L NaHCO3调pH至7.0，4 000×g离心10 min，取上清液-20℃下保存备用，实验平行进行3次。
（3） JFP-Ps在体外模拟小肠中的消化
参照中国药典方法配制肠液：磷酸二氢钾6.8 g，加500 mL蒸馏水溶解，用4%氢氧化钠溶液调节pH至（6.8±0.1）。另取胰酶10 g，加适量蒸馏水溶解；再将两液混合，加蒸馏水稀释至1 000 mL，4℃保存备用。
重复唾液和模拟胃液的消化过程，于37℃水浴中分别温育15 min 和1 h后，取出样品，然后分别加入人工肠液（反应液与肠液体积比为10∶3），再置于37 °C恒温条件下，分别反应5、20 min和1、2、4、8 h，反应结束后取出样品于沸水浴中灭酶15 min， 4000 xg离心10 min，取上清液-20℃下保存备用，实验平行进行3次。
1.2.2 JFP-Ps消化液抗氧化活性测定
（1） 羟基自由基清除作用研究
1.2.3 统计学分析
所有实验数据均用Excel 2007、origin 8.5、SPSS 20.0等软件处理完成。所有实验结果均用平均值±标准差（ x±s）表示。采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），Duncan检验，p<0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 JFP-Ps消化液对·OH的清除作用
JFP-Ps消化液对·OH的清除作用如图1所示。体外模拟唾液消化过程中，JFP-Ps消化液对·OH的清除率在15 min内升高，后略有降低并趋于稳定，且在唾液消化15 min时，自由基清除率最大，为（84.61±0.34）%（图1-A）。体外模拟胃液消化阶段，JFP-Ps消化液的·OH清除率在5 min至4 h内随着消化时间的延长而呈增加趋势，自由基清除率在胃液消化4 h时最大，为（89.93±0.36）%（图1-B）。在体外模拟小肠液消化过程中，JFP-Ps消化液的 ·OH清除率在5 min至8 h内随着消化时间的增加而呈上升趋势，在小肠液消化8 h时最大，为（95.51±3.61）%（图1-C）。表明经体外模拟胃肠消化的JFP-Ps消化产物对 ·OH有较强的清除能力。
2.2 JFP-Ps消化液对O2-·的清除作用 图2-A是邻苯三酚的自氧化曲线，吸光度值随反应时间的延长而稳定增加，反应体系的吸光度值与反应时间线性关系良好，相关系数达0.988 9。体外模拟胃肠道消化过程中JFP-Ps消化液O2-·清除规律如图2-B～2-D所示。在体外模拟唾液消化过程中，JFP-Ps消化液O2-·清除率在15 min内持续增加，而后清除率降低并趋于稳定，在唾液消化15 min时，自由基清除率达到最大为（15.96±0.72）%。在体外模拟胃液消化过程中，JFP-Ps人工胃液消化产物O2-·清除率呈不规律变化，在胃液消化1 h时，清除率达到最大为21.38±1.74%。在体外模拟人工肠液消化1 h内，自由基清除率持续降低，1～8 h内呈上升趋势，清除率在小肠液消化8 h时达到最大，为（59.74±3.12）%。结果表明JFP-Ps在唾液、胃液及肠液消化环境下消化产物均具有O2-·清除能力。
2.3 JFP-Ps消化液对DPPH·的清除作用
图3显示，JFP-Ps体外模拟胃肠道消化过程中DPPH·清除率的变化规律。体外模拟唾液消化15 min内JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持续增加，15 min至1 h内随着消化时间的延长自由基清除率降低并趋于稳定，消化15 min时，自由基清除率达到最大，为（5.33±0.27）%。体外人工胃液模拟胃液消化1 h内，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持续增加，1～4 h内随着消化时间的增加自由基清除率降低并趋于稳定，自由基清除率在胃液消化1 h达到最大为（6.54±0.83）%。体外模拟人工肠液消化过程中，随着消化时间的延长，消化产物DPPH·清除活性持续增加，清除率在小肠液消化8 h时达到最大，为（12.07±0.21）%。表明JFP-Ps胃肠液消化产物具有DPPH·清除能力。
3 讨论与结论
化合物的抗氧化活性可归因于多种机制：如破坏自由基链、防止自由基的引入、抑制脂质过氧化物的分解、单线态氧猝灭、超氧离子清除等[18]。可通过羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、ABTS自由基清除率以及还原能力等测定来评估和比较化合物的抗氧化性能。
·OH是活性氧物质中最活泼的自由基，其半衰期非常短，大约为10-9 s，与靶分子之间反应的速率很高，这使得其成为一种对生物分子造成严重损伤，对机体非常危险的化合物[19-21]。抗氧化剂对·OH的清除活性是评价其抗氧化活性的重要指标。Zhu等[15]通过自由基清除活性研究菠萝蜜多糖（JFP-Ps）体外抗氧化活性，结果表明，JFP-Ps（1 mg/mL）对·OH的清除率为68.30%。本实验结果表明，唾液消化、人工胃液及人工肠液消化三个不同的消化阶段中，JFP-Ps消化产物对·OH的清除能力与消化时间有一定的关系，在模拟唾液消化15 min，人工胃液消化4 h和人工肠液消化8 h时，JFP-Ps消化产物的 ·OH清除率达到最大，分别为（84.61±0.34）%、（89.93±0.36）%和（95.51±3.61）%，说明JFP-Ps经过体外模拟消化后仍然具有较强的·OH清除活性，且对其抗氧化活性具有促进作用。
O2-·是一种高毒性物质，是分子氧单电子还原产生的一种阴离子自由基，可与其他分子相互作用产生活性氧物质（ROS），如过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，对生物体有害[18， 22]。O2-·在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应产生稳定的O2-·与中间物，两者又发生反应产生一种在紫外有吸收的带有颜色产物，通过325 nm波长处的吸光度值的线性积累，可反映抗氧化物质O2-·清除能力的大小。本实验发现，在唾液、人工胃液和人工肠液三个消化阶段中，JFP-Ps消化产物对O2-·的清除率与消化时间相关，消化液的自由基清除率分别在唾液消化15 min、胃液消化1 h和小肠液消化8 h时达到最大，分别为（15.96±0.72）%、（21.38±1.74）%和（59.74±3.12）%，结果表明JFP-Ps经过体外模拟消化后其消化产物具有O2-·清除活性。
DPPH·是一种稳定的自由基，广泛用于评价天然化合物的抗氧化活性[23]。抗氧化剂与DPPH·相互作用，可以将电子或氢原子转移至DPPH·，形成稳定的DPPH-H化合物，反应物的颜色从暗紫色变为黄色，并且其在517 nm波长处的吸光度值降低。吸光度值降得越快，表明物质的抗氧化活性越强[24]。Vladimir Mihailovic等[25]研究表明，毛蕊花提取物经过体外模拟胃肠道消化后，其DPPH·清除活性呈降低趋势。Zhu等[15]研究表明，JFP-Ps在0.25～4 mg/mL对DPPH·的清除能力为（21.82%～69.64）%。本实验结果显示，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率分别在唾液消化15 min、人工胃液消化1 h和人工肠液消化8 h时达到最大，为（5.33±0.27）%、（6.54±0.83）%和（12.07±0.21）%，表明消化作用降低了JFP-Ps的DPPH·清除率，研究结果与文献报道一致[26-28]。
在胃肠消化过程中，活性物质可能受到pH、各种消化酶和温度等因素的影响，使其结构和性质发生变化，从而引起生物活性的变化[27， 29]。部分具有抗氧化活性的样品经体外消化后其抗氧化活性保持不变；而有一部分样品消化后具有更高或更低的抗氧化活性，可能是由于这些化合物在消化过程中水解形成具有更高或更低抗氧化活性的其他代谢产物[30-31]。
基于體外模拟胃肠消化的方法能够比较接近真实的生理消化过程，可用于研究天然产物多糖消化后抗氧化活性的变化规律。本文通过体外模拟胃肠消化研究JFP-Ps在消化过程中抗氧化能力的变化规律，研究发现JFP-Ps经过体外模拟胃肠消化后，其消化产物仍然具有较强的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。其中，在体外模拟唾液消化15 min时具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性；在体外模拟胃液消化4 h时具有最大的·OH清除活性，但在模拟胃液消化1 h时有最大的O2-·和DPPH·清除活性；在体外模拟小肠液消化8 h时具有对大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。本研究还发现，JFP-Ps经体外模拟胃肠消化后，与未消化的JFP-Ps相比，消化产物具有更高的·OH清除活性和较低的DPPH·清除活性，可能是由于JFP-Ps消化后其结构与化学性质发生了变化。 参考文献
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关键词 菠萝蜜多糖 ；体外消化 ；抗氧化活性 ；清除自由基
中图分类号 Q964.3 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.013
Abstract An attempt was made to investigate the change of the antioxidant activities of polysaccharides from jackfruit （Artocarpus heterophyllus Lam） pulps （JFP-Ps） during simulated gastrointestinal digestion in vitro. The antioxidant activities of the digested products of JFP-Ps， including hydroxyl radical （·OH） scavenging capacity， superoxide anion radical （O2-·） scavenging capacity and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH·） radical scavenging activity， were evaluated by simulating the digestion of human gastrointestinal tract in vitro. The evaluation found that during simulated gastrointestinal digestion in vitro the digested products of JFP-Ps had the ability of scavenging activities towards ·OH， O2-· and DPPH· radicals. When saliva digestion was simulated for 15min， the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities. When gastric digestion was simulated for 4 h， the digested products had the highest ·OH radical scavenging activities， while the highest O2-· and DPPH· radical scavenging activities were observed when gastric digestion was simulated for 1 h. And the digested products had the highest ·OH， O2-· and DPPH· radical scavenging activities when small intestinal digestion was simulated for 8 h. The results showed that after simulation of digestion in vitro JFP-Ps still exhibited strong ·OH radical scavenging activities and that their antioxidant activities were promoted.
Keywords polysaccharides from Artocarpus heterophyllus Lam. Pulp； digestion in vitro； antioxidant activity ； radical scavenging
多糖是由十個以上的单糖通过直链或支链糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，广泛存在于植物、动物和微生物中。目前，大量学者对多种多糖的体外消化进行了广泛研究，主要集中于多糖在消化模型中的性质变化、生物活性变化以及结构变化。梅娜娜等[1]研究发现，金钗石斛多糖在体外模拟消化过程中分子量降低，还原糖含量上升，但并未检测到单糖。Hu和ding等[2-3]分别研究了大粒车前子多糖和灵芝多糖在体外模拟胃肠道消化模型中的消化作用，发现他们的分子量均降低。红江蓠多糖、茯砖茶多糖和茶花多糖在模拟唾液、胃和小肠消化条件下没有发生降解，分子量、单糖含量和还原糖含量无显著变化[4-6]。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）为桑科木菠萝属热带水果，种植于印度、孟加拉国、斯里兰卡和中国南部等国家和地区[7-8]。菠萝蜜具有抗氧化、抑菌抗炎、防龋、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节和伤口愈合作用等多种功能活性，这些活性可能归因于菠萝蜜含有多种有益的化学成分，包括多糖类化合物、黄酮类化合物，甾醇类化合物和异戊二烯基黄酮类化合物等[9-12]。近年来，有关菠萝蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）的报道主要集中在多糖的提取、理化性质以及生理活性等方面。Tan等[10]研究发现，菠萝蜜果肉中粗多糖具有免疫增强活性。朱科学等[12-13]优化了水提醇沉法提取JFP-Ps的工艺，研究发现，JFP-Ps得率为6.18%，含有79.12%的总糖、5.83%的蛋白质、15.65%的糖醛酸和15种氨基酸，且具有显著的体外抗氧化活性；研究还发现，JFP-Ps的免疫活性增强可能与其促进小鼠脾淋巴细胞增殖、提高抗氧化活性及诱导细胞因子 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β分泌有关。 体外消化模型是通过模拟体内消化生理条件研究食物的消化特性，已广泛应用于营养学、药理学和食品化学等领域。目前，利用体外模拟人体胃肠道消化模型研究生物活性物质消化后的抗氧化活性变化，已经成为体外模拟人体消化技术的最新趋势[14]。但有关JFP-Ps在体外消化模型中的抗氧化活性评价鲜有报道。因此，本实验旨在通过体外模拟唾液、胃液以及小肠液消化的方法，评价JFP-Ps在消化过程中的抗氧化活性变化情况，以期为JFP-Ps在营养健康产品研发和膳食指导方面提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
菠萝蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp， JFP-Ps）主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸组成，平均分子量为1668 kDa[11]，由香料饮料研究所产品加工研究课题组提供。
体外消化酶：胃蛋白酶（猪源）和胰酶（来源于猪胰腺）购自阿拉丁试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）购自美国Sigma公司；邻菲罗啉购自北京索莱宝科技有限公司；Tris（三羟甲基氨基甲烷）购自广州赛国生物科技有限公司；磷酸二氢钾，硫酸亚铁，邻苯三酚，无水乙醇，HCl和H2O2购自西陇科学股份有限公司；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自广州化学试剂厂。
1.1.2 仪器与设备
DK-98-IIA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司生产；SHZ-B水浴恒温振荡器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司生产；SPECORD 250PLUS紫外/可见分光光度仪，德国耶拿分析仪器股份公司生产；Master-s-plus UVF 全自动超纯水系统，上海和泰仪器有限仪器公司生产；AL 104电子天平、FE20 pH计，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
（1） JFP-Ps唾液消化研究
挑选健康的志愿者2人（年龄20～30岁），收集唾液前，志愿者禁止饮食和喝水，用水漱口30 s，以获得中性的环境。然后将唾液在口腔聚集，受试者每隔60 s将其吐入试管，收集好的唾液4 000×g离心10 min以去除细胞，收集上清液备用。
分别取2 mL唾液置于8组试管，各加2 mL JFP-Ps溶液（4.0 mg/mL），用封口膜封口，充分混匀，37℃水浴进行消化实验，分别在5、10、15 、20、30 min和1 h取样，样品置于沸水浴灭酶15 min，将消化液用蒸馏水稀释至1 mg/mL，于4 000 ×g离心10 min，取上清液-20℃保存备用，实验平行进行3次。
（2） JFP-Ps体外模拟胃液消化研究
参照中國药典方法配制人工胃液：取16.4 mL HCl于烧杯中，加800 mL蒸馏水和10 g胃蛋白酶，加水稀释至1 000 mL，用1 mol/L NaHCO3调pH至（1.3±0.1），4℃保存备用。
JFP-Ps样品溶液经唾液消化15 min后分别加入等体积的人工胃液4 mL，密闭环境下于37℃水浴进行胃液消化，分别在5、15、30 min、1 、2、4 h取出样品于沸水浴中灭酶15 min，冷却至室温，1 mol/L NaHCO3调pH至7.0，4 000×g离心10 min，取上清液-20℃下保存备用，实验平行进行3次。
（3） JFP-Ps在体外模拟小肠中的消化
参照中国药典方法配制肠液：磷酸二氢钾6.8 g，加500 mL蒸馏水溶解，用4%氢氧化钠溶液调节pH至（6.8±0.1）。另取胰酶10 g，加适量蒸馏水溶解；再将两液混合，加蒸馏水稀释至1 000 mL，4℃保存备用。
重复唾液和模拟胃液的消化过程，于37℃水浴中分别温育15 min 和1 h后，取出样品，然后分别加入人工肠液（反应液与肠液体积比为10∶3），再置于37 °C恒温条件下，分别反应5、20 min和1、2、4、8 h，反应结束后取出样品于沸水浴中灭酶15 min， 4000 xg离心10 min，取上清液-20℃下保存备用，实验平行进行3次。
1.2.2 JFP-Ps消化液抗氧化活性测定
（1） 羟基自由基清除作用研究
1.2.3 统计学分析
所有实验数据均用Excel 2007、origin 8.5、SPSS 20.0等软件处理完成。所有实验结果均用平均值±标准差（ x±s）表示。采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），Duncan检验，p<0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 JFP-Ps消化液对·OH的清除作用
JFP-Ps消化液对·OH的清除作用如图1所示。体外模拟唾液消化过程中，JFP-Ps消化液对·OH的清除率在15 min内升高，后略有降低并趋于稳定，且在唾液消化15 min时，自由基清除率最大，为（84.61±0.34）%（图1-A）。体外模拟胃液消化阶段，JFP-Ps消化液的·OH清除率在5 min至4 h内随着消化时间的延长而呈增加趋势，自由基清除率在胃液消化4 h时最大，为（89.93±0.36）%（图1-B）。在体外模拟小肠液消化过程中，JFP-Ps消化液的 ·OH清除率在5 min至8 h内随着消化时间的增加而呈上升趋势，在小肠液消化8 h时最大，为（95.51±3.61）%（图1-C）。表明经体外模拟胃肠消化的JFP-Ps消化产物对 ·OH有较强的清除能力。
2.2 JFP-Ps消化液对O2-·的清除作用 图2-A是邻苯三酚的自氧化曲线，吸光度值随反应时间的延长而稳定增加，反应体系的吸光度值与反应时间线性关系良好，相关系数达0.988 9。体外模拟胃肠道消化过程中JFP-Ps消化液O2-·清除规律如图2-B～2-D所示。在体外模拟唾液消化过程中，JFP-Ps消化液O2-·清除率在15 min内持续增加，而后清除率降低并趋于稳定，在唾液消化15 min时，自由基清除率达到最大为（15.96±0.72）%。在体外模拟胃液消化过程中，JFP-Ps人工胃液消化产物O2-·清除率呈不规律变化，在胃液消化1 h时，清除率达到最大为21.38±1.74%。在体外模拟人工肠液消化1 h内，自由基清除率持续降低，1～8 h内呈上升趋势，清除率在小肠液消化8 h时达到最大，为（59.74±3.12）%。结果表明JFP-Ps在唾液、胃液及肠液消化环境下消化产物均具有O2-·清除能力。
2.3 JFP-Ps消化液对DPPH·的清除作用
图3显示，JFP-Ps体外模拟胃肠道消化过程中DPPH·清除率的变化规律。体外模拟唾液消化15 min内JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持续增加，15 min至1 h内随着消化时间的延长自由基清除率降低并趋于稳定，消化15 min时，自由基清除率达到最大，为（5.33±0.27）%。体外人工胃液模拟胃液消化1 h内，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率持续增加，1～4 h内随着消化时间的增加自由基清除率降低并趋于稳定，自由基清除率在胃液消化1 h达到最大为（6.54±0.83）%。体外模拟人工肠液消化过程中，随着消化时间的延长，消化产物DPPH·清除活性持续增加，清除率在小肠液消化8 h时达到最大，为（12.07±0.21）%。表明JFP-Ps胃肠液消化产物具有DPPH·清除能力。
3 讨论与结论
化合物的抗氧化活性可归因于多种机制：如破坏自由基链、防止自由基的引入、抑制脂质过氧化物的分解、单线态氧猝灭、超氧离子清除等[18]。可通过羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、ABTS自由基清除率以及还原能力等测定来评估和比较化合物的抗氧化性能。
·OH是活性氧物质中最活泼的自由基，其半衰期非常短，大约为10-9 s，与靶分子之间反应的速率很高，这使得其成为一种对生物分子造成严重损伤，对机体非常危险的化合物[19-21]。抗氧化剂对·OH的清除活性是评价其抗氧化活性的重要指标。Zhu等[15]通过自由基清除活性研究菠萝蜜多糖（JFP-Ps）体外抗氧化活性，结果表明，JFP-Ps（1 mg/mL）对·OH的清除率为68.30%。本实验结果表明，唾液消化、人工胃液及人工肠液消化三个不同的消化阶段中，JFP-Ps消化产物对·OH的清除能力与消化时间有一定的关系，在模拟唾液消化15 min，人工胃液消化4 h和人工肠液消化8 h时，JFP-Ps消化产物的 ·OH清除率达到最大，分别为（84.61±0.34）%、（89.93±0.36）%和（95.51±3.61）%，说明JFP-Ps经过体外模拟消化后仍然具有较强的·OH清除活性，且对其抗氧化活性具有促进作用。
O2-·是一种高毒性物质，是分子氧单电子还原产生的一种阴离子自由基，可与其他分子相互作用产生活性氧物质（ROS），如过氧化氢、羟基自由基和单线态氧，对生物体有害[18， 22]。O2-·在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应产生稳定的O2-·与中间物，两者又发生反应产生一种在紫外有吸收的带有颜色产物，通过325 nm波长处的吸光度值的线性积累，可反映抗氧化物质O2-·清除能力的大小。本实验发现，在唾液、人工胃液和人工肠液三个消化阶段中，JFP-Ps消化产物对O2-·的清除率与消化时间相关，消化液的自由基清除率分别在唾液消化15 min、胃液消化1 h和小肠液消化8 h时达到最大，分别为（15.96±0.72）%、（21.38±1.74）%和（59.74±3.12）%，结果表明JFP-Ps经过体外模拟消化后其消化产物具有O2-·清除活性。
DPPH·是一种稳定的自由基，广泛用于评价天然化合物的抗氧化活性[23]。抗氧化剂与DPPH·相互作用，可以将电子或氢原子转移至DPPH·，形成稳定的DPPH-H化合物，反应物的颜色从暗紫色变为黄色，并且其在517 nm波长处的吸光度值降低。吸光度值降得越快，表明物质的抗氧化活性越强[24]。Vladimir Mihailovic等[25]研究表明，毛蕊花提取物经过体外模拟胃肠道消化后，其DPPH·清除活性呈降低趋势。Zhu等[15]研究表明，JFP-Ps在0.25～4 mg/mL对DPPH·的清除能力为（21.82%～69.64）%。本实验结果显示，JFP-Ps消化液的DPPH·清除率分别在唾液消化15 min、人工胃液消化1 h和人工肠液消化8 h时达到最大，为（5.33±0.27）%、（6.54±0.83）%和（12.07±0.21）%，表明消化作用降低了JFP-Ps的DPPH·清除率，研究结果与文献报道一致[26-28]。
在胃肠消化过程中，活性物质可能受到pH、各种消化酶和温度等因素的影响，使其结构和性质发生变化，从而引起生物活性的变化[27， 29]。部分具有抗氧化活性的样品经体外消化后其抗氧化活性保持不变；而有一部分样品消化后具有更高或更低的抗氧化活性，可能是由于这些化合物在消化过程中水解形成具有更高或更低抗氧化活性的其他代谢产物[30-31]。
基于體外模拟胃肠消化的方法能够比较接近真实的生理消化过程，可用于研究天然产物多糖消化后抗氧化活性的变化规律。本文通过体外模拟胃肠消化研究JFP-Ps在消化过程中抗氧化能力的变化规律，研究发现JFP-Ps经过体外模拟胃肠消化后，其消化产物仍然具有较强的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。其中，在体外模拟唾液消化15 min时具有最大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性；在体外模拟胃液消化4 h时具有最大的·OH清除活性，但在模拟胃液消化1 h时有最大的O2-·和DPPH·清除活性；在体外模拟小肠液消化8 h时具有对大的·OH、O2-·和DPPH·清除活性。本研究还发现，JFP-Ps经体外模拟胃肠消化后，与未消化的JFP-Ps相比，消化产物具有更高的·OH清除活性和较低的DPPH·清除活性，可能是由于JFP-Ps消化后其结构与化学性质发生了变化。 参考文献
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