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苦荞种子中含有高活性的芦丁降解酶(Rutin Degrading Enzyme,RDE),芦丁降解酶属于β-D-糖苷酶家族,能够降解芦丁生成槲皮素和芸香糖苷,是造成苦荞面粉苦味的主要原因。本研究利用实验室已克隆的芦丁降解酶基因,设计引物扩增RDE基因组DNA,依据测序结果发现芦丁降解酶在基因组上存在3种拷贝形式rde1、rde2、rde3,其中rde1为无内含子的基因形式,rde2和rde3为有内含子的基因形式,rde3由12个外显子组成,rde2在rde3的第8外显子处插入新的内含子形成了13个外显子,两者相比外显子存在单碱基突变位点,内含子长度多态性是造成和两者差异的主要原因。相同的是rde2和rde3内含子中的AT含量高达70%,两者剪接位点碱基保守且遵循GT-AG规则。由此推测rde2和rde3可能为芦丁降解酶同源基因。在基因结构分析的基础上,构建rde真核重组表达载体pPICZαA-rde并转化毕赤酵母SMD1168H宿主菌,1%甲醇诱导诱导表达48 h后,表达上清硫酸铵分级沉淀,80%的丙酮洗涤溶解后,DEAE-Sepharose CL 6B纯化的蛋白经SDS-PAGE显示分子量为75KDa,重组芦丁降解酶(rRDE)分子量远大于预期分子量,PNGase F消化后分子量迁移到54 KDa,表明重组表达蛋白为N-连接的糖蛋白。研究建立了快速纯化苦荞籽粒芦丁降解酶的方法。利用芦丁降解酶对有机溶剂高耐受性的典型特性,基于不同浓度的甲醇对芦丁降解酶提取及活性的影响,结合非变性胶原位染色和酶活性分析确定芦丁降解酶提取最适甲醇浓度为40%,即在乙酸缓冲液提取后加入终浓度为40%的甲醇去除杂蛋白,在pH4.0条件下,提取液经强阳离子层析柱SP-Sepharose HP一步纯化得到分子量约为60 KDa的天然芦丁降解酶(nRDE),纯化效率可达70%左右。利用紫外分光光度计法对rRDE和nRDE的催化特性进行了比较分析,结果显示两者催化芦丁降解的最适p H均为5.0,rRDE最适温度为50℃,nRDE最适温度为40℃,催化芦丁的Km分别为5.375 mmol/L和11.333 mmol/L,nRDE的最大反应速率Vmax为是重组蛋白Vmax的10倍之多,推测不同来源芦丁降解酶翻译后修饰的不同是造成催化特性差异的主要原因。