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研究背景:肝癌恶性程度高、进展速度快,病理分类以肝细胞癌为主,其发病和预后存在明显的性别差异。当前研究发现雄激素受体（Androgenreceptor,AR）在前列腺癌和乳腺癌发生发展中起到关键作用。但是,肝癌中关于AR的研究存在较大争议,且AR单独作用不足以解释肝癌男性高发与不良预后。缺乏雄激素时,AR主要与热休克蛋白结合形成复合体存在细胞质中;而雄激素通过与胞质中的AR结合易位进入细胞核起到转录调控作用。性激素还是导致乙肝发病和不良预后性别差异化的重要原因。目前肝癌中AR研究还缺乏系统性,尤其是雄激素/HBx与AR协同作用的致癌机制研究较少,肝癌发生和预后的性别差异机制有待阐明。研究目的:重点研究雄激素与AR交互作用促进肝癌发生的致癌机制,初步探索HBx与AR的交互作用,解释肝癌男性高发和不良预后的机制,寻找肝癌治疗靶点。研究方法:本课题以AR促进肝癌发生的致癌机制研究为主线,以雄激素和HBx与AR交互作用为侧重点,从细胞模型和人群队列两个层面入手,利用转录组测序、机制研究和流行病学方法,进行关键科学问题的阐明。构建AR过表达和低表达细胞系,体外实验研究细胞的迁移、侵袭能力和凋亡水平变化,探索AR表达水平对致癌能力的影响;在双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT）刺激下,进一步探索雄激素与AR交互作用后的致癌能力变化。对AR过表达细胞进行转录组测序,通过生信分析,寻找AR调控的潜在关键分子。通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）实验研究AR致癌机制,确定AR的关键靶基因,以及在DHT刺激下AR转录调控能力的变化,并初步探索HBx/DHT协同作用对AR启动子活性的改变。体外实验研究靶基因功能,通过siRNA下调靶基因表达,观察肝癌细胞的迁移、侵袭能力与凋亡改变情况。结合人群样本,通过实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）方法检测肝癌组织和癌旁组织中的AR表达水平,比较AR表达水平与性别和肿瘤复发的关系。利用Kaplan-Meier plotter在线公共数据库liver cancer数据集,通过生存分析研究靶基因与生存时间和无复发时间的关系。研究结果:1.分别利用HepG2细胞系和SK-HEP1细胞系构建AR高表达和低表达细胞系（及对照细胞系）,通过transwell实验和流式细胞凋亡实验发现:较对照组HepG2细胞系（HepG2 EGFP）,高表达AR的HepG2细胞系（HepG2 OE-AR）的迁移、侵袭能力提高而凋亡比例下降;较对照组SK-HEP1细胞系（SK-HEP1 siNC）,低表达AR的SK-HEP1细胞系（SK-HEP1 siAR）的迁移、侵袭能力下降而凋亡比例上升。使用双氢睾酮DHT刺激HepG2细胞系发现:较对照组（0.1%DMSO）,100 nM DHT处理的HepG2细胞迁移、侵袭能力增强而凋亡比例减少。上述结果提示:较高的AR表达水平可以增强细胞迁移、侵袭能力并减少细胞凋亡,雄激素刺激能增强AR致癌能力。2.分别对HepG2 EGFP细胞和HepG2 OE-AR细胞进行转录组测序,生信分析发现18条迁移侵袭相关通路,22条凋亡相关通路。通过qRT-PCR和Western blot验证发现AR表达水平与BIRC7、IGFBP3、NTSR1和NDUFA4L2表达水平正相关,且与转录组测序结果一致。通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验证明AR可以结合靶基因BIRC7、IGFBP3和NTSR1的启动子区发挥转录调控作用;且雄激素刺激可以进一步增强AR上调靶基因BIRC7、IGFBP3和NTSR1表达能力。上述结果提示:AR可以上调靶基因BIRC7、IGFBP3和NTSR1表达,且雄激素可以增强AR对靶基因的转录调控作用。3.利用 siRNA 敲低 HepG2 和 SK-HEP1 细胞中 BIRC7、IGFBP3 和 NTSR1 表达,经transwell实验和流式细胞凋亡实验发现:较敲低对照组细胞（siNC）,BIRC7敲低细胞（siBIRC7）凋亡比例增加,而迁移和侵袭能力无统计学差异;较敲低对照组细胞（siNC）,IGFBP3敲低细胞（siIGFBP3）侵袭能力降低、凋亡比例增加,而迁移能力无统计学差异;较敲低对照组细胞（siNC）,NTSR1敲低细胞（siNTSR1）迁移和侵袭能力降低,凋亡比例增加。上述结果提示:靶基因BIRC7、IGFBP3和NTSR1具有致癌作用。4.双荧光素酶报告基因实验还发现:无雄激素作用时,野生型WT-HBx（Wild-type HBx）较对照Vector组AR启动子活性无统计学差异,而Ct-HBx（carboxylic acid-terminal truncated HBx）较 WT-HBx（或 Vector）AR 启动子活性显著升高;雄激素作用时,较对照组（0.1%DMSO）,100nM DHT处理后WT-HBx可以显著增强AR启动子活性。上述结果说明:WT-HBx调控AR转录是依赖于雄激素的。5.利用人肝癌组织与癌旁组织,经qRT-PCR检测的AR表达水平,结果发现:在女性患者中,AR表达水平在肝癌组织和癌旁组织中无统计学差异,在男性患者中,肝癌组织中AR表达水平较癌旁组织低。AR表达水平在男性肝癌组织与女性肝癌组织中无统计学差异,AR表达水平在男性癌旁组织与女性癌旁组织中无统计学差异。AR表达水平在复发肝癌组织与非复发肝癌组织中无统计学差异。上述结果提示:AR单独作用可能不是肝癌男性不良预后的主要因素。6.利用Kaplan-Meier plotter在线工具liver cancer数据集,通过生存分析研究在不同性别中靶基因水平与总生存时间（Overall survival,OS）和无复发生存时间（Relapse-free survival,RFS）的关系,结果发现:在男性肝癌患者中,BIRC7高表达患者的OS和RFS较BIRC7低表达患者短;IGFBP3高表达患者OS和RFS较IGFBP3低表达患者短;NTSR1高表达患者OS和RFS较NTSR1低表达患者短。而在女性肝癌患者中,BIRC7高表达患者OS和RFS与BIRC7低表达患者无统计学差异;IGFBP3高表达患者OS较IGFBP3低表达患者短,而RFS较IGFBP3低表达患者无统计学差异;NTSR1高表达患者OS和RFS较NTSR1低表达患者延长。上述结果说明:BIRC7、IGFBP3和NTSR1对肝癌患者的预后影响是存在性别差异,其高表达可能导致男性肝癌患者不良预后。研究结论:本研究发现,AR调控靶基因BIRC7、IGFBP3和NTSR1发挥致癌作用,雄激素可以增强AR对靶基因的转录调控能力,并导致肝癌发生和预后的性别差异。此外,Ct-HBx能增加AR启动子活性。