【摘 要】
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黄酮化合物（Flavonoids）是一种广泛存在于植物中的多酚化合物,具有抗氧化、抗菌、抗炎及保肝护肝等多种生物活性,在食品医药领域应用广泛。邻羟基化反应是其重要的修饰反应,由加氧酶催化,能增强其生物活性。该反应主要由P450酶催化,但P450是膜蛋白,在原核生物中可溶性差、表达困难。因此,开发能在原核生物中高效表达的单加氧酶对于黄酮化合物的生物合成具有重要的研究价值。本研究通过筛选、结构分析及改
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黄酮化合物（Flavonoids）是一种广泛存在于植物中的多酚化合物,具有抗氧化、抗菌、抗炎及保肝护肝等多种生物活性,在食品医药领域应用广泛。邻羟基化反应是其重要的修饰反应,由加氧酶催化,能增强其生物活性。该反应主要由P450酶催化,但P450是膜蛋白,在原核生物中可溶性差、表达困难。因此,开发能在原核生物中高效表达的单加氧酶对于黄酮化合物的生物合成具有重要的研究价值。本研究通过筛选、结构分析及改造,获得了高效催化黄酮化合物羟基化的单加氧酶Ro Hpa BY215A。首先通过基因组挖掘及进化树分析,选取了Escherichia coli、Rhodococcus opacus、Klebsiella Pneumoniae及Pseudomonas putida四种来源的Hpa B。通过体外酶活分析,比较了它们对对羟基苯乙酸（4HPA）和柚皮素的催化活性。结果表明相比其他三种酶,Ro Hpa B对柚皮素具有明显的底物偏好性,对柚皮素的催化效率（kcat/Km）为240.80 s-1 M-1。添加柚皮素在体内培养24 h,能催化生成78.37 mg/L的圣草酚。进一步通过结构建模、分子对接及动力学模拟分析不同来源的Hpa B的结构差异,发现位于Ro Hpa B底物结合口袋入口处的Loop212-222链长明显短于Ec Hpa B和Kp Hpa B,测量底物口袋体积,发现Ro Hpa B的底物口袋体积确实大于Ec Hpa B和Kp Hpa B,这可能是Ro Hpa B能更好地容纳柚皮素的关键因素。通过结构置换、丙氨酸扫描对这个loop区进行改造,并通过饱和突变对底物口袋附近8（?）距离的氨基酸残基进行改造,最终获得了高催化活性的工程酶Ro Hpa BY215A。Ro Hpa BY215A对柚皮素的催化效率为6360.95 s-1 M-1,较Ro Hpa B提高了26.42倍。添加柚皮素,最高可生成414.93 mg/L的圣草酚,是目前报道的在大肠杆菌中生物转化生成圣草酚的最高产量。将Ro Hpa BY215A应用于黄酮类化合物芹菜素、黄酮醇类化合物山奈酚及异黄酮类化合物金雀异黄酮的羟基化。Ro Hpa BY215A对金雀异黄酮的催化效率（1877.93 s-1 M-1）较Ro Hpa B（78.46 s-1 M-1）提高了23.93倍。Ro Hpa BY215A对芹菜素的催化效率为15.58 s-1 M-1,对山奈酚的催化效率为10.59 s-1 M-1,而Ro Hpa B对芹菜素和山奈酚的催化效率太低无法测出。此外本研究首次将Hpa B用于芹菜素和金雀异黄酮的羟基化,拓展了Hpa B的底物谱。本研究获得的Ro Hpa BY215A对黄酮化合物的催化效率明显提高,为生物合成黄酮化合物的衍生物提供了高效的生物元件。
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