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谷氨酸是哺乳动物脑中最重要的兴奋性递质之一。它从细胞中持续地释放出来,然后在细胞外以再摄取的方式被清除,以保持非常低的胞外浓度从而避免对细胞产生谷氨酸兴奋性毒性。这种基本的神经功能得以实现取决于在胶质细胞和神经元质膜上表达的兴奋性氨基酸转运蛋白（excitatory amino acid transporters,EAATs）。尽管神经胶质细胞和神经元均表达EAATs,但目前认为神经胶质细胞中表达的EAATs具有比神经元更强的谷氨酸转运能力,尤其是星形胶质细胞谷氨酸转运体亚型EAAT2,介导了大脑中90%的谷氨酸吸收。作为EAATs重要的子类型,EAAT2在小脑和海马甚至整个大脑的神经元中都高度表达。由于EAAT2在海马神经元轴突末端高表达,因此在维持突触谷氨酸稳态和调节线粒体功能方面被认为起着重要作用。近年来,一些研究报道称EAAT2的异常功能或表达参与多种精神和神经疾病的发病机制,例如帕金森氏病（Parkinson’s disease,PD）,阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease,AD）,亨廷顿氏病（Huntington’s disease,HD）,肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）,癫痫病和脑外伤（Traumatic brain injury,TBI）等。此外,EAATs对谷氨酸的转运是生电性的,这一过程涉及到3个Na+和1个H+的共同转运以及1个K+的反向转运。EAATs的转运机制和药理学的最新进展基于对其原核同系物GltPh及真核子类型EAAT1cryst晶体结构的解析。GltPh由三个相同的亚基单体组成,每个单体结构包含八个跨膜结构域（Transmembrane domain,TM）1-8和两个高度保守的折返螺旋发夹结构hairpin loop 1,HP1 和hairpin loop 2,HP2)。TM1-TM6形成围绕转运蛋白核心的氨基末端圆柱体,并为转运蛋白的构象变化提供结构支持,而更保守的TM7和TM8以及HP1和HP2构成转运蛋白核心,负责与底物和离子结合。目前认为HP2是参与底物反应的细胞外门控,而HP1则形成细胞内门控。通过对原核晶体结构的研究,TM3-4环在运输过程中经历了底物敏感的构象变化,是运输机制的重要组成部分。但是通过EAAT1cryst晶体结构所揭示的TM3-4环结构和功能方面的信息十分有限。通过我们的前期研究结果发现EAAT2TM2在谷氨酸转运过程中起到了重要作用,依据TM2中残基的特殊位置和在转运过程中所负的重要功能,我们认为该跨膜结构域可能参与EAAT2阴离子渗透途径的组成。但目前EAATs阴离子渗透的机制仍未彻底明确。本课题主要用基因定点突变、半胱氨酸突变对交联、电生理的方法,旨在揭示TM3-4环与底物转运通道的关系和在底物转运中所负的功能,阐明TM2在EAATs阴离子渗透机制中的重要作用,对彻底阐明EAATs的转运机制提供理论基础。第一章EAAT2底物转运过程中TM3-4环与HP2的相对运动为了探索TM3-4环在运输周期中的空间位置和功能,我们在无半胱氨酸的EAAT2（cysteine-less EAAT2,CL-EAAT2）中的 TM3-4 环和 HP2 之间引入了一些成对的半胱氨酸突变体。我们观察到Cu（Ⅱ）（1,10-菲咯啉）3[Cu（Ⅱ）（1,10-phenanthroline）3,CuPh]对A167C/G437C突变体具有显著的运输抑制作用,而二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）逆转了氧化交联作用对A167C/G437C对运输活性的影响,这证实了 CuPh对突变体的影响是由于转运蛋白分子中二硫键的形成。我们观察到A167C/G437C的Vmax降低,而Km显著升高,动力学参数的结果进一步表明,二硫键的形成损害了 A167C/G437C的运输活性,并且A167C/G437C对底物的亲和力显著下调,在运输过程中,A167或G437位点可能与底物的结合有关。D,L-苏-β-苄氧基-天冬氨酸（D,L-threo-benzyloxyaspartate,D,L-TBOA）减弱A167C/G437C突变体的CuPh抑制作用,而L-谷氨酸或KCl增强A167C/G437C突变体的CuPh抑制作用,表明A167C和G437C半胱氨酸在向外构象中相距较远,而在向内构象中相距较近。我们提供的证据表明,TM3-4环和HP2在运输周期中会改变空间接近度。另外,我们发现当转运蛋白在转运周期中采用向外构象时,G437C残基的水相通透性降低,这表明G437C具有构象敏感性,并可能在EAAT2的运输周期中发挥作用。此外,我们证明了 MTSET对于A167C和G437C的水相通透性,这清楚地表明G437位于细胞外。总而言之,我们的工作表明,TM3-4环和HP2在运输周期中可能非常接近,TM3-4环可能在底物易位中起重要作用,另外TM3-4环和HP2可能相互作用以调节转运蛋白与底物结合中的构象变化。第二章EAAT2底物转运过程中TM2对阴离子通道功能的影响为了研究转运过程中TM2中的关键氨基酸残基对EAAT2阴离子通道功能产生的影响,我们在HeLa细胞中瞬时表达了 EAAT2及突变体,并通过全细胞膜片钳实验测量EAAT2相关电流。我们发现在添加0.5mmol/L谷氨酸后,P95A引起了 EAAT2电流的时间和电压依赖性的显著性变化,而R87K,R87S和K90R突变体的电流则没有显示出这种依赖性。与WTEAAT2相比,在用SCN-溶液代替部分Cl-溶液后,P95A EAAT2中存在和不存在L-谷氨酸之间的电流改变幅度显著降低并且与WTEAAT2相比,P95A阴离子电流明显降低,这表明P95A降低了 EAAT2相关的阴离子电流。结合我们前期研究结果表明,EAAT2TM2P95位点丙氨酸突变导致的结构和性质变化与EAAT2相关的阴离子通道的性质改变有关。